Phytomedicine | 湖北中醫藥大學團隊揭示大黃甘草湯通過SIRT3介導NRF2去乙酰化抑制急性腎損傷中鐵死亡

摘要

背景：急性腎損傷（AKI）是膿毒癥的主要并發癥，亟需探索新的治療方式。中藥大黃甘草湯（DHGC）在治療膿毒癥相關急性腎損傷（SA-AKI）方面具有潛力，但具體機制仍需進一步研究。

目的：本研究旨在驗證大黃甘草湯在體內外治療膿毒癥相關急性腎損傷中抑制鐵死亡的作用。

方法：采用脂多糖（LPS）誘導 C57BL/6 小鼠和 C57BL/6 背景的沉默信息調節因子 3（SIRT3）敲除（SIRT3?/?）小鼠，使用 erastin 誘導正常和 SIRT3 小干擾 RNA（si-SIRT3）轉染的人近端腎小管上皮（HK-2）細胞建立鐵死亡模型，隨后進行大黃甘草湯處理。首先，通過液相色譜 - 串聯質譜法（LC-MS/MS）鑒定大黃甘草湯的成分，并通過與高效液相色譜（HPLC）參考標準對比進一步篩選潛在活性成分。采用生化檢測、透射電子顯微鏡（TEM）、免疫組織化學、免疫熒光和細胞計數試劑盒 - 8（CCK-8）檢測等方法，評估體內外鐵死亡水平及大黃甘草湯的保護機制。通過 RNA 測序（RNA-seq）鑒定關鍵通路，并采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）和蛋白質印跡法（Western blotting）驗證。最后，將潛在活性成分與 SIRT3 進行分子對接，篩選候選單體用于后續體外功能驗證。

結果：脂多糖成功誘導小鼠膿毒癥相關急性腎損傷，erastin 成功誘導 HK-2 細胞鐵死亡。大黃甘草湯可改善腎功能、提高細胞活力，并逆轉鐵死亡關鍵指標的異常變化。機制上，建模后 SIRT3 / 核因子紅細胞 2 相關因子 2（NRF2）通路相關蛋白表達下調，NRF2 核轉位受抑；而大黃甘草湯可上調 SIRT3/NRF2 通路相關蛋白表達，促進 NRF2 核轉位，激活下游谷胱甘肽過氧化物酶 4（GPX4）表達。重要的是，在 SIRT3 缺陷模型中，大黃甘草湯無法改善上述指標。通過 HPLC 參考標準對比篩選出大黃甘草湯的潛在活性成分，經與 SIRT3 分子對接鑒定出候選單體，這些單體具有與大黃甘草湯一致的鐵死亡抑制作用。

結論：本研究首次證實，大黃甘草湯通過激活 SIRT3 介導的 NRF2 去乙酰化，促進 NRF2 核轉位，抑制鐵死亡，從而延緩膿毒癥相關急性腎損傷的進展。這些發現表明大黃甘草湯是治療膿毒癥相關急性腎損傷的潛在候選藥物，值得進一步臨床研究。

圖1.與 HPLC 參考標準的對比。（A）大黃甘草湯提取物在 LC-MS/MS 分析中的負離子模式；（B）大黃甘草湯提取物在 LC-MS/MS 分析中的正離子模式。

圖2.膿毒癥相關急性腎損傷模型的建立。（A）動物實驗方案示意圖；（B）血清尿素氮（BUN）水平指示的腎功能評估；（C）血清肌酐（SCr）水平；（D-F）血清炎癥細胞因子（腫瘤壞死因子 -α（TNF-α）、白細胞介素 - 6（IL-6）、白細胞介素 - 1β（IL-1β））的定量分析；（G）腎組織中鐵離子（Fe2?）含量的測定；（H-J）氧化應激標志物（血清超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）水平、谷胱甘肽（GSH）水平）的評估；（K）腎小管損傷評分的定量分析；（L）腎臟病理變化的代表性圖像，通過 H&E 染色評估腎臟組織學（×400，比例尺 = 50μm），免疫組織化學染色檢測 GPX4 和 4 - 羥基壬烯醛（4-HNE）表達（×400，比例尺 = 50μm），透射電子顯微鏡觀察線粒體超微結構（×12000，比例尺 = 1.0μm）。

圖3.體外鐵死亡模型的建立。（A-D）不同濃度和時長 erastin 處理的 HK-2 細胞經 CCK-8 assay 檢測的細胞活力；（E）Fer-1 對細胞活力的影響；（F-H）細胞內氧化應激標志物（GSH 和 MDA）的定量分析；（I-K）細胞內鐵水平（Fe2?、Fe3?和總鐵）的測定；（L）熒光強度指示的細胞內活性氧（ROS）水平代表性圖像（×200，比例尺 = 50μm）；（M-N）脂質過氧化（C11-BODIPY）和亞鐵離子（FerroOrange）的代表性熒光圖像（×400，比例尺 = 20μm）。

圖4.大黃甘草湯逆轉膿毒癥相關急性腎損傷小鼠腎組織中的腎損傷、炎癥反應、氧化應激和鐵死亡。（A）實驗設計時間線；（B-C）大黃甘草湯對腎功能標志物（BUN 和 SCr）的影響（n=6）；（D-F）大黃甘草湯對氧化應激標志物（MDA、GSH 和 SOD）的影響（n=6）；（G）腎組織 Fe2?含量分析（n=6）；（H）腎臟病理和鐵死亡標志物的代表性圖像，H&E 染色顯示組織學結構（×400，比例尺 = 50μm），免疫組織化學染色檢測 GPX4 和 4-HNE（×400，比例尺 = 50μm），透射電子顯微鏡顯示線粒體超微結構（×12000、×400，比例尺 = 1.0μm）；（I）差異表達 mRNA 的火山圖（紅色：上調；藍色：下調）；（J）主成分分析（PCA）圖顯示各組間的明顯聚類；（K）差異表達基因的熱圖；（L-N）腎組織中 SIRT3、GPX4、長鏈脂酰輔酶 A 合成酶 4（ACSL4）、核 NRF2 和乙酰化 NRF2（ac-NRF2）表達的蛋白質印跡分析和定量（β- 肌動蛋白（β-actin）和層粘連蛋白 B1（Lamin B1）作為內參）（n=3）。

圖5.大黃甘草湯可恢復 HK-2 細胞活力并減輕氧化應激和鐵死亡。（A）不同大黃甘草湯濃度下 CCK-8 assay 檢測的細胞活力；（B-D）SOD、MDA 和 GSH 水平；（E-G）細胞內鐵水平（Fe2?、Fe3?和總鐵）；（H-K）脂質過氧化（C11-BODIPY）和亞鐵離子積累（FerroOrange）的代表性熒光圖像（×400，比例尺 = 20μm）；（L-N）SIRT3、GPX4、ACSL4、核 NRF2 和 ac-NRF2 的蛋白質印跡分析和定量密度測定。

圖6.在 SIRT3?/?小鼠中，大黃甘草湯無法通過去乙酰化改善理化指標或鐵死亡。（A-B）腎功能參數（BUN 和 SCr）（n=6）；（C-E）血清炎癥細胞因子（TNF-α、IL-6 和 IL-1β）（n=6）；（F）腎小管損傷評分定量（n=6）；（G）H&E 染色、GPX4/4-HNE 免疫組織化學（×400，比例尺 = 50μm）和透射電子顯微鏡線粒體觀察（×12000，比例尺 = 1.0μm）的代表性圖像；（H-J）氧化應激標志物（SOD、GSH 和 MDA）（n=6）；（K）腎組織 Fe2?含量（n=6）；（L-N）SIRT3/NRF2 通路相關蛋白的蛋白質印跡分析（n=3）。

圖7.在 SIRT3 敲低的 HK-2 細胞中，大黃甘草湯無法通過 SIRT3 介導的 NRF2 去乙酰化減輕鐵死亡。（A）細胞活力（CCK-8 assay）；（B-D）細胞內 GSH、MDA 和 SOD 水平；（E-G）鐵代謝指標（Fe2?、Fe3?和總鐵）；（H）C11-BODIPY 染色檢測脂質過氧化的代表性熒光圖像（×400，比例尺 = 20μm）；（I-K）通路蛋白的蛋白質印跡定量；（L）評估 NRF2 核轉位的代表性共聚焦顯微鏡圖像（×600，比例尺 = 10μm）；（M）大黃酸與 SIRT3 的分子對接可視化；（N-R）大黃酸單體對細胞活力和鐵死亡標志物的影響。

圖8.大黃甘草湯通過 SIRT3/NRF2 通路改善膿毒癥相關急性腎損傷鐵死亡的示意圖。

結論

本研究結果表明，大黃甘草湯通過激活 SIRT3 介導的 NRF2 去乙酰化，促進 NRF2 核轉位，從而減輕鐵死亡。這些發現提示 SIRT3/NRF2 通路是膿毒癥相關急性腎損傷的潛在治療靶點，并提供了支持大黃甘草湯在此背景下治療潛力的臨床前數據。

DOI: 10.1016/j.phymed.2025.157724

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