動物行為實驗指南丨光纖記錄結合五項選擇連續反應時任務（5-CSRTT）

限水階段

小鼠經過三天的適應性飼養，進入連續8天的限制性供水階段，供水時間依次為4h、3.5h、3h、2.5h、2h、1.5h、1h、0.5h，在每日上午十點稱量其體重，當小鼠體重低于前體重的90%時，可以認為小鼠的限制性斷水取得了理想的結果，如低于前重量的80%時，應注意小鼠的健康狀況，防止因過量缺水導致行動能力下降甚至死亡。限水結束后進行行為學訓練，之后的每天行為訓練結束后，定時補水15min。

適應性訓練階段

健康狀況達到標準的小鼠，進入到適應性訓練階段，此階段分為四個階段：在第一階段，運行5-choice Habituation1程序（10min），此階段小鼠可以自由的在操作箱中進行探索，操作箱的屏幕和槽燈此階段都不會被點亮，也不提供糖水獎勵。在第二階段，運行5-choice Habituation2（30min，100試次），此階段五孔屏幕燈不會亮，但是食物口槽燈會亮，當小鼠觸碰槽燈后將獲得液體獎勵（2%蔗糖），小鼠通過反復觸碰槽燈，在此階段建立起槽燈和糖水獎勵之間的連接。當小鼠完成100試次或者實驗累積時間達到30min后一輪實驗結束。當獲得獎賞的次數≥50次，小鼠進入到第三階段，否則重復第二階段，直到達標為止。第三階段，運行的是5-choice Touch Training程序（30min，100試次），隨機點亮5塊屏幕(4cm×4cm)，當小鼠觸碰屏幕后，操作箱的槽燈被點亮，小鼠觸碰被點亮的槽燈后，隨即槽口泵出糖水，給予其獎勵。接著五塊屏幕將隨機被點亮（無間隔時間）以進入下一個試次。獲得獎勵次數≥50次的小鼠進入第四階段。第四階段運行的是5-choice Touch Training4程序（30min，100試次），此階段與第三階段基本相同，不同之處在于，小鼠獲得獎勵后，有一個5秒的時間間隔。當小鼠的正確試次≥50次時，就進入到訓練階段。

- 小鼠五孔注意力測試系統，上海欣軟 -

訓練階段

小鼠在完成適應性訓練階段后進入到訓練階段。訓練階段為循序漸進的難度遞進模式，共有6個階段。其中階段1屏幕亮屏時間(Stimulus duration,SD)持續30秒，30s的回合時間(Limited hold,LH)，以及2s的間隔時間(interval,ITI)。首先操作箱的槽燈亮起，小鼠觸碰其槽口，測試開始于5s Timeout(TO)之后。然后五塊屏幕被隨機點亮一個，當小鼠在SD時間內正確的觸碰屏幕時，將會出現聲音反饋提醒其操作正確。于此同時，槽燈將亮起，在LD時間內小鼠觸碰槽口，將給予糖水獎勵，隨后在ITI之后開始下一個試次。當小鼠的反應為過早(premature)、遺漏(omission)或者不正確（incorrect）時，程序會給予TO懲罰，伴隨著操作箱的室燈有5s的亮燈間隔。當小鼠能夠連續兩天都滿足進階標準時，將進入下一階段的訓練程序。下一階段的SD和LD時間相對縮短，ITI的時間有所延長。

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測試階段

一旦小鼠在階段6中達到穩定的性能，就進入到測試階段。在光纖鈣成像實驗中，選擇第4階段（SD5-LH5-ITI5）進行測試。在化學遺傳學實驗中，選擇階段6（SD1.8-LH5-ITI5）常規測試以及LITI（SD1.8-LH5-ITI7）挑戰測試進行實驗。每次測試時間為30分鐘。

(3)aIC的坐標位點通過使用小鼠腦圖譜來確定，確定目標位點后，開始鉆孔，鉆孔使用顱骨鉆直徑為0.6mm。如將病毒注射在PVT腦區以及LSv腦區也進行如上準備工作，然后將微量注射器緩緩地插入aIC腦區、PVT腦區以及LSv腦區進行病毒注射。

（4）前側島葉（aIC）病毒注射具體坐標為：DV（dorsal-ventral，小鼠腦背側到腹側）：-3.2mm、AP（anterior-posterior，前端到后端）：+2.22mm、ML（medial-lateral，內側到外側）：+2mm；丘腦室旁核（PVT）具體坐標為：DV：-3mm、AP：-1.46mm、ML：+0.1mm；腹側外側隔核具體坐標為：DV：-3.9mm、AP：+0.74mm、ML：+0.6mm。

（5）順行示蹤病毒：AAV-hSyn-EGFP，注射時采取5nl/min注射速度，注射總量為50nl；逆行示蹤病毒：rAAV-retro-EGFP，注射時同樣采取5nl/min注射速度，注射量也為50nl。在小鼠病毒注射完成后，微量注射器至少停針10min，待10min后，再緩緩地將微量注射器移出來，以防止病毒回流。

在體光纖記錄

實驗人員在進行在體光纖記錄實驗前，首先需檢查和測試在體光纖的控制儀器運行是否正常。將光纖線纜激光的接口端插入儀器的激發光源端，并旋轉使其緊密連接，然后開啟激光器，對光纖線電纜的出口進行光強度的檢測和觀察，避免因部分殘缺導致光纖線中間漏光或接觸不良。完成設備的調試后，即可開始進行光纖套管的插入工作。實驗者先對小鼠進行安撫，避免其受到應激刺激，待小鼠的狀態穩定后，將其放置于厚海綿墊上，用手指輕輕的按住小鼠的頭部，使其不能夠輕易的晃動，用蘸有酒精的棉簽擦拭陶瓷光纖，使其保持清潔狀態，再將光纖線纜的末端輕輕旋轉使其能夠插入小鼠頭部外側的陶瓷插芯的尾端中，從而使激光光束能夠順利的通過插芯傳導到目標區域處，最后將小鼠緩緩松開，輕放入五孔測試箱中，先讓其自由活動5-10min,使其能夠適應頭部攜帶的元件。

適應結束后小鼠開始行為學測試，記錄小鼠在stage4階段的鈣信號，有30min的測試時間。每只小鼠完成行為學實驗后，用75%的酒精擦拭設備箱，以免小鼠氣味和排泄物干擾下一只小鼠的測試。最后通過錄制的實驗視頻確定小鼠四個動作（正確、錯誤、提前、遺漏）發生的時間點，再通過F-Scope軟件分析鈣信號的峰值變化。

小鼠5-CSRTT模型及評價

選用7-8周齡的雄性C57BL/6小鼠作為實驗鼠，實驗開始前進行為期三天的環境適應，再開始四個階段的適應性訓練，小鼠完成適應性訓練后，進入到正式訓練階段。此階段為難度遞進式，SD的時間隨著訓練減短，而ITI的時間隨著訓練增長，參數的變化要求小鼠更高的注意力。此模型通過四個行為指標來評價小鼠的注意力，為正確反應、錯誤反應、過早反應以及漏報。對完成5-CSRTT小鼠行為指標進行統計分析，隨著Stage的進階，小鼠的正確次數變多，精確率也相應地提升，而漏報沒有差異。表明成功構建了小鼠5-CSRTT模型。

五項選擇連續反應時任務（5-CSRTT）

A.5-CSRTT模型構建時間軸。B.5-CSRTT任務的執行過程。C.5-CSRTT行為學數據評價。隨著stage的遞進，正確次數增多，精確率提高，遺漏無差異

為了進一步確認aIC谷氨酸能神經元與注意力之間的關系，使用在體光纖記錄法監測小鼠的神經元活動，可以記錄小鼠行為時細胞內鈣離子（Ca2+）瞬間的變化。在C57BL/6小鼠的aIC腦區單側注射AAV-CaMKII-GCaMP6s病毒，劑量為300nl，然后再通過手術將光纖套管植入在aIC上方，待病毒表達后，使用GCaMP6熒光鈣傳感器記錄aIC谷氨酸能神經元群體的活動。小鼠病毒注射后，使其休息一周，再開始5-CSRTT行為學訓練。GCaMP6s的表達以及光纖位置的確定通過免疫熒光的方法進行確認。小鼠體內鈣信號的測量在5-CSRTT任務中記錄，小鼠完成5-CSRTT訓練后，且行為穩定后，選擇stage4進行在體光纖測試。根據5-CSRTT任務的行為指標，將記錄的數據分為四組：正確反應，錯誤反應，遺漏以及提前反應。為了將aIC谷氨酸能神經元活動與行為指標進行時間的匹配，需將記錄的小鼠行為視頻與光纖測量系統同步。通過分析數據作者發現，與其他三組行為指標相比，當小鼠在5-CSRTT中響應注意行為時，aIC中谷氨酸能神經元鈣離子顯著升高，提示aIC谷氨酸能神經元的活性顯著增加。當小鼠響應注意行為時面積明顯高于其他三組行為。小鼠aIC谷氨酸能神經元響應正確行為時鈣離子升高。

響應注意行為時aIC谷氨酸能神經元鈣信號激活增強

注意事項

動物在訓練過程中會獲得一定的獎賞，因此在保證動物正常的生理狀態下，需要控制動物的飲食或飲水，以避免動物因為飽腹而減少動機行為，從而影響實驗結果。因為對于行為學實驗來說，動物保持一個良好的狀態很重要，在整個實驗過程中，動物訓練、測試和喂食的時間應盡量保持一致。其次，應保證同一只實驗鼠的訓練和測試的五孔設備箱為同一個，從而避免因為環境的微小變化對實驗結果的影響。研究人員應根據自己的課題合理化的設置訓練參數和測試參數，統計方法尤其需要根據實驗設計和數據類型來選擇。

參考文獻：

• The Paraventricular Nucleus of the Thalamus Is an Important Node in the Emotional Processing Network.[J]. Barson Jessica R;Mack Nancy R;Gao WenJun.Frontiers in behavioral neuroscience,2020

• Heterogeneity in the Paraventricular Thalamus: The Traffic Light of Motivated Behaviors.[J]. McGinty Jacqueline F;Otis James M.Frontiers in behavioral neuroscience,2020

• 馬影屏. 小鼠注意力調控核團篩選及其機制初探[D].安徽醫科大學,2024.

• Proteomic Profile of a Chronic Binge Ethanol Exposure Model.[J]. Starski Phillip;;Peyton Lee;;Oliveros Alfredo;;Heppelmann Carrie J;;Dasari Surendra;;Choi Doo-Sup.Journal of proteome research,2019

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