王成坤/鮑堅(jiān)強(qiáng)團(tuán)隊(duì)等開發(fā)系列新型基因編輯工具：實(shí)現(xiàn)大片段DNA的高效精準(zhǔn)敲入

編輯丨王多魚

排版丨水成文

CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)已成為 21 世紀(jì)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最具突破性的基因編輯工具，在基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)方面展現(xiàn)巨大潛力。然而，CRISPR/Cas9 技術(shù)仍面臨許多亟須解決的技術(shù)挑戰(zhàn)。其一，精準(zhǔn)且安全編輯挑戰(zhàn)。CRISPR/Cas9 技術(shù)依賴基因組 DNA 雙鏈斷裂（DSB）或單鏈斷裂（SSB）來(lái)介導(dǎo)基因編輯事件發(fā)生。斷裂的 DNA 極易誘發(fā)非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)通路，進(jìn)一步引發(fā)潛在的基因組不穩(wěn)定性和細(xì)胞毒性效應(yīng)。其二，長(zhǎng)片段高效插入挑戰(zhàn)。現(xiàn)有基因編輯工具大多用于短序列 DNA 片段的插入或編輯，同源定向修復(fù)（HDR）作為介導(dǎo)精準(zhǔn)大片段基因敲入的關(guān)鍵修復(fù)機(jī)制，受限于特定的細(xì)胞周期。因此，其固有效率難以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)片段 DNA（千堿基級(jí)）的精準(zhǔn)插入。

2026 年 1 月 22 日，南京醫(yī)科大學(xué)王成坤教授、韓峰教授及中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)鮑堅(jiān)強(qiáng)研究員團(tuán)隊(duì)合作（羅怡寧、蔣琴、屈元昊和李文卿為論文共同第一作者），在Nucleic Acids Research期刊發(fā)表了題為：Compact bacterial recombination complexes drive efficient kilobase-scale knock-in in mammalian cells的研究論文。

該研究通過系統(tǒng)性功能篩選，開發(fā)了一種基于微生物來(lái)源EcRecE核酸外切酶的精準(zhǔn)基因編輯工具——Cas9-EcRecE，該編輯系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中顯著提高長(zhǎng)片段DNA（千堿基級(jí)）的精準(zhǔn)插入效率。同時(shí)，基于dCas9，該研究進(jìn)一步構(gòu)建了無(wú)需依賴 DNA雙鏈斷裂（DSB）的安全基因組編輯工具——dCas9-EcRecTE，為實(shí)現(xiàn)安全高效的基因編輯提供新的技術(shù)支持。

為實(shí)現(xiàn)高效且精準(zhǔn)的 HDR 修復(fù)，王成坤研究團(tuán)隊(duì)的前期工作已闡明噬菌體來(lái)源的 SSAP-RecT 可顯著增強(qiáng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中千堿基級(jí) DNA 片段的精準(zhǔn)插入效率，并基于此開發(fā)了REDIT（RecE/T-mediated DNA Integration Technology）大片段敲入技術(shù)（Wang et al., 2021, Nucleic Acids Research）及dCas9-SSAP（Wang et al., 2022, Nature Cell Biology），但這兩項(xiàng)技術(shù)的編輯效率仍有提升空間。

RecE 核酸外切酶是源自 Rac 原噬菌體的另一關(guān)鍵同源重組蛋白，常與 RecT 單鏈退火蛋白（SSAP）協(xié)同發(fā)揮作用。在微生物同源重組過程中，RecE 核酸外切酶沿 5'-3' 方向切割斷裂DNA末端形成 3' 單鏈懸垂，而 RecT 單鏈退火蛋白則通過鏈退火或鏈交換促進(jìn)重組過程的完成。

基于 SAM 招募（MS2-MCP系統(tǒng)）策略，研究團(tuán)隊(duì)評(píng)估了 3 種微生物核來(lái)源酸外切酶，并成功挖掘大腸桿菌來(lái)源的EcRecE能顯著增強(qiáng) HDR 活性（圖1），在多類型細(xì)胞和多個(gè)基因位點(diǎn)展現(xiàn)出強(qiáng)大的編輯普適性。此外，EcRecE 的應(yīng)用不會(huì)顯著增加 Cas9 的脫靶風(fēng)險(xiǎn)，是一種安全且精準(zhǔn)的新型基因編輯工具。

圖1

進(jìn)一步，研究團(tuán)隊(duì)通過優(yōu)化同源修復(fù)模板、蛋白核定位信號(hào)和發(fā)開迷你型 EcRecE等手段開發(fā)了基于miniRecE、miniRecTE和saCas9的雙 AAV 遞送策略，在 HEK293T 細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了 ~20% 的 HDR 效率，為體內(nèi)基因編輯提供了可行方案（圖2）。

圖2

值得注意的是，研究團(tuán)隊(duì)同樣利用 EcRecE 開發(fā)了不依賴 DNA 雙鏈斷裂的dCas9-EcRecTE基因編輯工具，并在 HEK293T 細(xì)胞以及原代小鼠神經(jīng)元中實(shí)現(xiàn)高效的長(zhǎng)片段DNA（千堿基級(jí)）的精準(zhǔn)插入（圖3）。

圖3

總的來(lái)說(shuō)，該研究通過系統(tǒng)性挖掘微生物來(lái)源同源重組關(guān)鍵蛋白，首次開發(fā)基于 EcRecE 核酸外切酶及其迷你型變體的高效基因編輯工具。這一新型基因組編輯工具不僅突破了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中千堿基級(jí)外源 DNA 片段難以實(shí)現(xiàn)高效插入的技術(shù)瓶頸，更創(chuàng)新性地實(shí)現(xiàn)了無(wú)基因組損傷的高效dCas9-EcRecTE 基因編輯工具，為基因治療及相關(guān)臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。

2025 年 12 月 10 日，中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)鮑堅(jiān)強(qiáng)/程臨釗團(tuán)隊(duì)聯(lián)合南京醫(yī)科大學(xué)王成坤團(tuán)隊(duì)及山東大學(xué)劉洪彬/張友明團(tuán)隊(duì)（李文卿、劉森泉、方曉雨和鄒佳琦為論文共同第一作者），在Nature Communications期刊發(fā)表了題為：Efficient high-precision transgene knock-in by Recombinases (Redα/β)-enhanced DNA integration-CRISPR-Cas9 (RED-CRISPR) 的研究論文。

該研究報(bào)道了基于λ 噬菌體的同源重組系統(tǒng)（Redα/Redβ）增強(qiáng) CRISPR/Cas9 介導(dǎo)大片段 DNA（千堿基級(jí)）精準(zhǔn)編輯技術(shù)——RED-CRISPR系統(tǒng)。

Redα/Redβ 系統(tǒng)是源自 λ 噬菌體的另一高效同源重組 系統(tǒng)。其中，Redα 為 5'→3' 核酸外切酶，Redβ 是單鏈 DNA 退火蛋白。Redα/β 系統(tǒng)與 RecE/T 系統(tǒng)具有相似的同源重組機(jī)制，有望在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中介導(dǎo)介導(dǎo)大片段 DNA （千堿基級(jí)）精準(zhǔn)、高效的插入。

在這一新研究中，研究團(tuán)隊(duì)通過優(yōu)化招募方式、蛋白間 linker 和核定位信號(hào)（NLS）等方法，最終驗(yàn)證了Cas9-Redα-Redβ 融合蛋白這一組合能顯著提高哺乳動(dòng)物細(xì)胞中 HDR 的活性（在 HEK293T細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)了 ~20% 的 IRES-mCherry敲入效率），優(yōu)于其他組合。因此，研究團(tuán)隊(duì)將 Cas9-Redα-Redβ 命名為RED-CRISPR系統(tǒng)。

進(jìn)一步，通過聯(lián)用 RED-CRISPR、小分子 HDR 增強(qiáng)劑、CTS 同源修復(fù)模板，最終可在細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn) ＞40% 的千堿基級(jí) DNA敲入效率。值得注意的是，GUIDE-seq 和 PEM-seq 分析揭示RED-CRISPR系統(tǒng)編輯時(shí)脫靶編輯事件和染色質(zhì)易位事件顯著降低，且不會(huì)表明未造成額外的細(xì)胞毒性。因此，RED-CRISPR具有更高的安全性，有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

最后，研究團(tuán)隊(duì)利用 RED-CRISPR 系統(tǒng)開展了許多疾病應(yīng)用探索。RED-CRISPR 系統(tǒng)能在人類原代 T 細(xì)胞及iPSC中的實(shí)現(xiàn)了有效 mKate 熒光蛋白的敲入，且未顯著影響細(xì)胞正常的生理功能。同時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)也在鐮狀細(xì)胞病（SCD）相關(guān)的 iPSC 細(xì)胞系（TNC1），實(shí)現(xiàn)了HBB cDNA 精準(zhǔn)的插入。進(jìn)一步，研究團(tuán)隊(duì)探索了 RED-CRISPR 系統(tǒng)介導(dǎo)大片段基因敲入小鼠模型構(gòu)建及CAR-T細(xì)胞制備的能力。

研究結(jié)果顯示，利用 RED-CRISPR 可有效介導(dǎo) T 細(xì)胞在 TRAC 位點(diǎn)精準(zhǔn)敲入約 2 kb 的 2A-CAR-pA 表達(dá)盒，編輯效率相較 Cas9 提升至44.3%，并檢測(cè)到較低的脫靶事件及染色質(zhì)易位事件的發(fā)生效率；而 RED-CRISPR 系統(tǒng)也可有效進(jìn)行大片段基因敲入以制備大片段基因敲入小鼠模型，效率相較 Cas9 組效率提升了17 倍。

總的來(lái)說(shuō)，該研究證實(shí)，RED-CRISPR 系統(tǒng)作為一種高效精準(zhǔn)的千堿基級(jí)外源 DNA 整合技術(shù)，在多個(gè)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景，包括：大片段轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的高效構(gòu)建、CAR-T細(xì)胞制備等免疫治療基因工程改造，以及致病性基因突變位點(diǎn)的精準(zhǔn)校正等臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用場(chǎng)景。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1093/nar/gkag020

https://doi.org/10.1038/s41467-025-67239-w