西湖大學(xué)開(kāi)發(fā)相分離遞送技術(shù)，重塑多種原代細(xì)胞CRISPR基因編輯治療新格局

基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas9被譽(yù)為“分子剪刀”，因其高效、精準(zhǔn)和可編程的特性，迅速成為生物醫(yī)學(xué)研究中的核心工具之一。這項(xiàng)革命性技術(shù)不僅極大地推動(dòng)了基礎(chǔ)生命科學(xué)的發(fā)展，也為遺傳病、腫瘤等重大疾病的治療提供了全新的策略。在眾多應(yīng)用方向中，各類(lèi)功能細(xì)胞（尤其是免疫細(xì)胞和干細(xì)胞）的基因改造尤其受到關(guān)注。例如，原代 T 細(xì)胞作為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵執(zhí)行者，是開(kāi)發(fā) CAR-T、TCR-T 等前沿細(xì)胞療法的重要載體；NK 細(xì)胞憑借其獨(dú)特的靶向殺傷機(jī)制，成為 CAR-NK 等新型免疫治療的熱點(diǎn)對(duì)象；而干細(xì)胞的基因編輯更是在再生醫(yī)學(xué)與多種難治性疾病的治療中展現(xiàn)出廣闊前景。對(duì)這類(lèi)原代細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)高效的基因編輯，已成為生物醫(yī)學(xué)研究及臨床轉(zhuǎn)化的重要前沿。

然而，盡管 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)本身具備強(qiáng)大的編輯能力，其在原代免疫細(xì)胞和干細(xì)胞中的實(shí)際應(yīng)用仍面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。這些細(xì)胞來(lái)源于人體外周血、組織或特定分化階段，具有高度的生理敏感性和有限的體外擴(kuò)增能力。它們對(duì)環(huán)境變化極為敏感，容易發(fā)生凋亡、分化或功能耗竭，且細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)往往致密，對(duì)外源大分子物質(zhì)的攝入效率極低。這些共性生物學(xué)特性使得將 CRISPR 組件高效、安全地遞送進(jìn)細(xì)胞內(nèi)部成為制約基因編輯成功的關(guān)鍵瓶頸。

目前常用的遞送方法在各類(lèi)原代細(xì)胞中各有局限。脂質(zhì)體或陽(yáng)離子聚合物等化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑在易轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中可能表現(xiàn)良好，但在原代 T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞或干細(xì)胞中往往效率低下且細(xì)胞毒性顯著；電穿孔技術(shù)雖能提高外源物質(zhì)的導(dǎo)入率，但強(qiáng)烈的電流脈沖會(huì)對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)造成不可逆損傷，導(dǎo)致細(xì)胞存活率大幅下降、分化異常或功能喪失，嚴(yán)重影響后續(xù)研究與治療應(yīng)用；病毒載體雖然轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高，卻存在插入突變風(fēng)險(xiǎn)、免疫原性反應(yīng)以及生產(chǎn)復(fù)雜、成本高等問(wèn)題，在干細(xì)胞編輯中尤其需考慮其長(zhǎng)期安全性，因此在臨床前研究中仍限制較多。

因此，如何在不損害細(xì)胞活力的前提下，實(shí)現(xiàn) CRISPR 基因編輯組件的高效遞送，已成為提升基因編輯效率和臨床應(yīng)用可行性的核心難題。理想的遞送系統(tǒng)應(yīng)兼具高轉(zhuǎn)染效率、低細(xì)胞毒性、良好的細(xì)胞功能維持以及臨床轉(zhuǎn)化潛力，才能滿(mǎn)足從基礎(chǔ)科研到治療開(kāi)發(fā)的多元需求。

一、CRISPR-Cas9工作機(jī)制：精準(zhǔn)的基因“剪刀”

CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)源于對(duì)細(xì)菌免疫機(jī)制的研究。自然界中，細(xì)菌和古菌為抵御噬菌體等外來(lái)遺傳物質(zhì)的入侵，演化出一套基于 CRISPR 序列的記憶性防御系統(tǒng)。經(jīng)過(guò)科學(xué)改造，這一系統(tǒng)已被轉(zhuǎn)化為一種強(qiáng)大而靈活的基因編輯工具，廣泛應(yīng)用于基因敲除、插入、調(diào)控等多種操作。

關(guān)鍵組分：

• Cas9 蛋白：一種核酸內(nèi)切酶，負(fù)責(zé)切割 DNA 雙鏈。

• sgRNA（單鏈向?qū)NA）：引導(dǎo) Cas9 蛋白靶向特定基因序列。

編輯過(guò)程：

• 靶向定位：sgRNA 通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合到目標(biāo) DNA 序列。

• DNA 切割：Cas9 在 sgRNA 引導(dǎo)下切割 DNA，形成雙鏈斷裂（DSB）。

• DNA 修復(fù)：細(xì)胞通過(guò)非同源末端連接（NHEJ）或同源定向修復(fù)（HDR）修復(fù)斷裂，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除或插入。

CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于其高度的可編程性和靶向特異性，只需更換 sgRNA 序列即可靶向不同基因，極大提升了實(shí)驗(yàn)的靈活性與效率。然而，無(wú)論編輯設(shè)計(jì)多么精巧，若無(wú)法將其有效遞送至目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)部，尤其是像原代免疫細(xì)胞及干細(xì)胞這類(lèi)“難轉(zhuǎn)染”細(xì)胞，再先進(jìn)的編輯策略也難以發(fā)揮其應(yīng)有作用。

二、ProteanFect?遞送Cas9基因編輯系統(tǒng)——原代免疫細(xì)胞、干細(xì)胞等基因編輯新策略

為突破原代免疫細(xì)胞、干細(xì)胞等難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因編輯中的遞送瓶頸，西湖凝聚體與西湖大學(xué)聯(lián)合開(kāi)發(fā)了 ProteanFect?CRISPRMax Ultra 轉(zhuǎn)染試劑盒。該系統(tǒng)基于創(chuàng)新的生物分子凝聚體技術(shù)，專(zhuān)為高效遞送 RNP 復(fù)合物/Cas9 mRNA-sgRNA 復(fù)合物至難轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞（原代 T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、干細(xì)胞等）而設(shè)計(jì)，展現(xiàn)出卓越的轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞兼容性，為免疫學(xué)與細(xì)胞治療研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

與傳統(tǒng)遞送方式不同，ProteanFect?不依賴(lài)脂質(zhì)包裹或電穿孔等物理化學(xué)手段，而是模擬細(xì)胞內(nèi)天然的相分離現(xiàn)象，利用功能性?xún)?nèi)源蛋白與 CRISPR-Cas9 基因編輯系統(tǒng)自發(fā)組裝形成動(dòng)態(tài)的生物分子凝聚體。這種凝聚體結(jié)構(gòu)能夠溫和地?cái)y帶 RNP 復(fù)合物/Cas9 mRNA-sgRNA 復(fù)合物，通過(guò)細(xì)胞的內(nèi)吞途徑進(jìn)入胞內(nèi)，避免了劇烈處理對(duì)細(xì)胞造成的應(yīng)激損傷。

ProteanFect?遞送系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)基因編輯的分子機(jī)制如下（圖1）：

• 凝聚體組裝：RNP/Cas9 mRNA-sgRNA 與 ProteanFect?內(nèi)源蛋白一起組裝成為凝聚體復(fù)合物；

• 細(xì)胞攝取：凝聚體通過(guò)胞吞吸收，遞送進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；

• 胞內(nèi)釋放與轉(zhuǎn)運(yùn)：復(fù)合物釋放并進(jìn)入細(xì)胞核與靶 DNA 結(jié)合；

• 靶向編輯：精準(zhǔn)切割靶基因，實(shí)現(xiàn)高效基因編輯。

圖1. ProteanFect?RNP-based CRISPR及mRNA-based CRISPR遞送原理

這一遞送策略有效規(guī)避了電穿孔帶來(lái)的高細(xì)胞死亡率和病毒載體潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)在編輯效率上優(yōu)于傳統(tǒng)化學(xué)試劑的轉(zhuǎn)染方法。更重要的是，使用 ProteanFect?處理后的原代細(xì)胞通常保持較高的存活率和功能完整性，有利于后續(xù)的功能驗(yàn)證、擴(kuò)增或回輸實(shí)驗(yàn)。該系統(tǒng)的操作極為簡(jiǎn)便，無(wú)需復(fù)雜的設(shè)備或繁瑣的預(yù)處理步驟。

ProteanFect?CRISPRMax Ultra的出現(xiàn)，標(biāo)志著原代免疫細(xì)胞基因編輯正從“高難度操作”向“標(biāo)準(zhǔn)化流程”轉(zhuǎn)變。它不僅提升了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性與成功率，也為大規(guī)模篩選、多基因編輯以及臨床前研究提供了可靠的技術(shù)平臺(tái)。

三、ProteanFect?CRISPRMax Ultra高效基因編輯各種原代細(xì)胞成功案例

1. 小鼠原代 T 細(xì)胞

利用ProteanFect?CRISPRMax Ultra 小鼠免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒（貨號(hào)：PT09）對(duì)小鼠原代 T 細(xì)胞進(jìn)行基因編輯：采用 Trac sgRNA/Cas9 蛋白（RNP）轉(zhuǎn)染的方案，結(jié)果如下圖 2 所示。基因組水平檢測(cè)（圖2左）顯示小鼠T細(xì)胞整體 DNA 突變率達(dá) 84.3%，蛋白水平檢測(cè)（圖2右）顯示蛋白敲低效率達(dá) 86.3%。

圖2. 使用ProteanFect?CRISPRMax Ultra小鼠免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒對(duì)小鼠原代T細(xì)胞進(jìn)行基因編輯

2. 人原代 T 細(xì)胞

利用ProteanFect?CRISPRMax Ultra 轉(zhuǎn)染試劑盒（貨號(hào)：PT08）對(duì)人原代 T 細(xì)胞進(jìn)行基因編輯：采用 TRAC sgRNA/Cas9 蛋白（RNP）轉(zhuǎn)染的方案，結(jié)果如下圖 3 所示。基因組水平檢測(cè)（圖2左）顯示人 T 細(xì)胞整體 TRAC 突變率達(dá) 80.1%，蛋白水平檢測(cè)（圖2右）顯示蛋白敲低效率達(dá) 85%。

圖3. 使用ProteanFect?CRISPRMax Ultra轉(zhuǎn)染試劑盒對(duì)人原代T細(xì)胞進(jìn)行基因編輯

3.iPSC 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

來(lái)自斯坦福大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)利用 ProteanFect?成功遞送 PE7 基因編輯系統(tǒng)至 PBMC 來(lái)源的 iPSC，并實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)點(diǎn)突變（c.757G>T），堿基替換效率達(dá) 55%，進(jìn)一步驗(yàn)證了該試劑在難轉(zhuǎn)染干細(xì)胞中的高效基因編輯能力（圖4）。

圖4. 使用ProteanFect?遞送PE7系統(tǒng)進(jìn)入iPSC進(jìn)行基因編輯

四、邁向高效與溫和的基因編輯新時(shí)代

隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和細(xì)胞治療的快速發(fā)展，對(duì)多種功能細(xì)胞進(jìn)行高效基因編輯的需求正持續(xù)增長(zhǎng)。無(wú)論是免疫細(xì)胞（例如 T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）還是多能干細(xì)胞或造血干細(xì)胞，其在疾病建模、再生醫(yī)學(xué)和新型細(xì)胞療法開(kāi)發(fā)中都占據(jù)核心地位。而像 ProteanFect?這樣的創(chuàng)新遞送技術(shù)，正在為這一廣闊領(lǐng)域注入新的活力。它不僅是一項(xiàng)技術(shù)進(jìn)步，更代表了一種研究范式的轉(zhuǎn)變——使我們能夠以更溫和、更高效的方式與細(xì)胞“對(duì)話(huà)”，在最大程度保持細(xì)胞功能與狀態(tài)的前提下，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的精準(zhǔn)調(diào)控。

未來(lái)已來(lái)，基因編輯的大門(mén)正因這些關(guān)鍵而細(xì)膩的技術(shù)突破越開(kāi)越大。對(duì)于每一位致力于免疫治療、基因工程與再生醫(yī)學(xué)的研究者而言，掌握一類(lèi)高效、安全且適用于多種難編輯細(xì)胞類(lèi)型的遞送工具，或許正是邁向下一代生物醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)與臨床轉(zhuǎn)化的第一步。

關(guān)于西湖凝聚體

西湖凝聚體生物是專(zhuān)注于核酸遞送領(lǐng)域的國(guó)家級(jí)高新技術(shù)企業(yè)，已服務(wù)國(guó)內(nèi)外大量頂尖高校及科研機(jī)構(gòu)。我們成功研發(fā)了全球首個(gè)基于哺乳動(dòng)物內(nèi)源蛋白的凝聚體核酸遞送平臺(tái)，為高效基因遞送提供了創(chuàng)新解決方案。

我們的首個(gè)產(chǎn)品 ProteanFect?轉(zhuǎn)染試劑系列，顯著提升了原代細(xì)胞和難轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的基因遞送效率，助力全球科研工作者更高效便捷地開(kāi)展基因研究。同時(shí)，我們正與全球藥企和生物技術(shù)公司緊密合作，開(kāi)發(fā)一系列前沿基因治療臨床產(chǎn)品。歡迎全球研究者和合作伙伴與我們攜手，共同推進(jìn)更創(chuàng)新、更高性能的基因遞送系統(tǒng)和產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。

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