西湖大學開發(fā)相分離遞送技術(shù)，重塑多種原代細胞CRISPR基因編輯治療新格局

基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas9被譽為“分子剪刀”，因其高效、精準和可編程的特性，迅速成為生物醫(yī)學研究中的核心工具之一。這項革命性技術(shù)不僅極大地推動了基礎(chǔ)生命科學的發(fā)展，也為遺傳病、腫瘤等重大疾病的治療提供了全新的策略。在眾多應(yīng)用方向中，各類功能細胞（尤其是免疫細胞和干細胞）的基因改造尤其受到關(guān)注。例如，原代 T 細胞作為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵執(zhí)行者，是開發(fā) CAR-T、TCR-T 等前沿細胞療法的重要載體；NK 細胞憑借其獨特的靶向殺傷機制，成為 CAR-NK 等新型免疫治療的熱點對象；而干細胞的基因編輯更是在再生醫(yī)學與多種難治性疾病的治療中展現(xiàn)出廣闊前景。對這類原代細胞進行精準高效的基因編輯，已成為生物醫(yī)學研究及臨床轉(zhuǎn)化的重要前沿。

然而，盡管 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)本身具備強大的編輯能力，其在原代免疫細胞和干細胞中的實際應(yīng)用仍面臨嚴峻挑戰(zhàn)。這些細胞來源于人體外周血、組織或特定分化階段，具有高度的生理敏感性和有限的體外擴增能力。它們對環(huán)境變化極為敏感，容易發(fā)生凋亡、分化或功能耗竭，且細胞膜結(jié)構(gòu)往往致密，對外源大分子物質(zhì)的攝入效率極低。這些共性生物學特性使得將 CRISPR 組件高效、安全地遞送進細胞內(nèi)部成為制約基因編輯成功的關(guān)鍵瓶頸。

目前常用的遞送方法在各類原代細胞中各有局限。脂質(zhì)體或陽離子聚合物等化學轉(zhuǎn)染試劑在易轉(zhuǎn)染細胞系中可能表現(xiàn)良好，但在原代 T 細胞、NK 細胞或干細胞中往往效率低下且細胞毒性顯著；電穿孔技術(shù)雖能提高外源物質(zhì)的導(dǎo)入率，但強烈的電流脈沖會對細胞膜和細胞穩(wěn)態(tài)造成不可逆損傷，導(dǎo)致細胞存活率大幅下降、分化異常或功能喪失，嚴重影響后續(xù)研究與治療應(yīng)用；病毒載體雖然轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高，卻存在插入突變風險、免疫原性反應(yīng)以及生產(chǎn)復(fù)雜、成本高等問題，在干細胞編輯中尤其需考慮其長期安全性，因此在臨床前研究中仍限制較多。

因此，如何在不損害細胞活力的前提下，實現(xiàn) CRISPR 基因編輯組件的高效遞送，已成為提升基因編輯效率和臨床應(yīng)用可行性的核心難題。理想的遞送系統(tǒng)應(yīng)兼具高轉(zhuǎn)染效率、低細胞毒性、良好的細胞功能維持以及臨床轉(zhuǎn)化潛力，才能滿足從基礎(chǔ)科研到治療開發(fā)的多元需求。

一、CRISPR-Cas9工作機制：精準的基因“剪刀”

CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)源于對細菌免疫機制的研究。自然界中，細菌和古菌為抵御噬菌體等外來遺傳物質(zhì)的入侵，演化出一套基于 CRISPR 序列的記憶性防御系統(tǒng)。經(jīng)過科學改造，這一系統(tǒng)已被轉(zhuǎn)化為一種強大而靈活的基因編輯工具，廣泛應(yīng)用于基因敲除、插入、調(diào)控等多種操作。

關(guān)鍵組分：

• Cas9 蛋白：一種核酸內(nèi)切酶，負責切割 DNA 雙鏈。

• sgRNA（單鏈向?qū)NA）：引導(dǎo) Cas9 蛋白靶向特定基因序列。

編輯過程：

• 靶向定位：sgRNA 通過堿基互補配對，結(jié)合到目標 DNA 序列。

• DNA 切割：Cas9 在 sgRNA 引導(dǎo)下切割 DNA，形成雙鏈斷裂（DSB）。

• DNA 修復(fù)：細胞通過非同源末端連接（NHEJ）或同源定向修復(fù)（HDR）修復(fù)斷裂，從而實現(xiàn)基因敲除或插入。

CRISPR-Cas9 系統(tǒng)的優(yōu)勢在于其高度的可編程性和靶向特異性，只需更換 sgRNA 序列即可靶向不同基因，極大提升了實驗的靈活性與效率。然而，無論編輯設(shè)計多么精巧，若無法將其有效遞送至目標細胞內(nèi)部，尤其是像原代免疫細胞及干細胞這類“難轉(zhuǎn)染”細胞，再先進的編輯策略也難以發(fā)揮其應(yīng)有作用。

二、ProteanFect?遞送Cas9基因編輯系統(tǒng)——原代免疫細胞、干細胞等基因編輯新策略

為突破原代免疫細胞、干細胞等難轉(zhuǎn)染細胞的基因編輯中的遞送瓶頸，西湖凝聚體與西湖大學聯(lián)合開發(fā)了 ProteanFect?CRISPRMax Ultra 轉(zhuǎn)染試劑盒。該系統(tǒng)基于創(chuàng)新的生物分子凝聚體技術(shù)，專為高效遞送 RNP 復(fù)合物/Cas9 mRNA-sgRNA 復(fù)合物至難轉(zhuǎn)染的原代細胞（原代 T 細胞、B 細胞、NK 細胞、干細胞等）而設(shè)計，展現(xiàn)出卓越的轉(zhuǎn)染效率與細胞兼容性，為免疫學與細胞治療研究提供了強有力的技術(shù)支持。

與傳統(tǒng)遞送方式不同，ProteanFect?不依賴脂質(zhì)包裹或電穿孔等物理化學手段，而是模擬細胞內(nèi)天然的相分離現(xiàn)象，利用功能性內(nèi)源蛋白與 CRISPR-Cas9 基因編輯系統(tǒng)自發(fā)組裝形成動態(tài)的生物分子凝聚體。這種凝聚體結(jié)構(gòu)能夠溫和地攜帶 RNP 復(fù)合物/Cas9 mRNA-sgRNA 復(fù)合物，通過細胞的內(nèi)吞途徑進入胞內(nèi)，避免了劇烈處理對細胞造成的應(yīng)激損傷。

ProteanFect?遞送系統(tǒng)實現(xiàn)基因編輯的分子機制如下（圖1）：

• 凝聚體組裝：RNP/Cas9 mRNA-sgRNA 與 ProteanFect?內(nèi)源蛋白一起組裝成為凝聚體復(fù)合物；

• 細胞攝取：凝聚體通過胞吞吸收，遞送進入細胞內(nèi)；

• 胞內(nèi)釋放與轉(zhuǎn)運：復(fù)合物釋放并進入細胞核與靶 DNA 結(jié)合；

• 靶向編輯：精準切割靶基因，實現(xiàn)高效基因編輯。

圖1. ProteanFect?RNP-based CRISPR及mRNA-based CRISPR遞送原理

這一遞送策略有效規(guī)避了電穿孔帶來的高細胞死亡率和病毒載體潛在的安全風險，同時在編輯效率上優(yōu)于傳統(tǒng)化學試劑的轉(zhuǎn)染方法。更重要的是，使用 ProteanFect?處理后的原代細胞通常保持較高的存活率和功能完整性，有利于后續(xù)的功能驗證、擴增或回輸實驗。該系統(tǒng)的操作極為簡便，無需復(fù)雜的設(shè)備或繁瑣的預(yù)處理步驟。

ProteanFect?CRISPRMax Ultra的出現(xiàn)，標志著原代免疫細胞基因編輯正從“高難度操作”向“標準化流程”轉(zhuǎn)變。它不僅提升了實驗的可重復(fù)性與成功率，也為大規(guī)模篩選、多基因編輯以及臨床前研究提供了可靠的技術(shù)平臺。

三、ProteanFect?CRISPRMax Ultra高效基因編輯各種原代細胞成功案例

1. 小鼠原代 T 細胞

利用ProteanFect?CRISPRMax Ultra 小鼠免疫細胞轉(zhuǎn)染試劑盒（貨號：PT09）對小鼠原代 T 細胞進行基因編輯：采用 Trac sgRNA/Cas9 蛋白（RNP）轉(zhuǎn)染的方案，結(jié)果如下圖 2 所示。基因組水平檢測（圖2左）顯示小鼠T細胞整體 DNA 突變率達 84.3%，蛋白水平檢測（圖2右）顯示蛋白敲低效率達 86.3%。

圖2. 使用ProteanFect?CRISPRMax Ultra小鼠免疫細胞轉(zhuǎn)染試劑盒對小鼠原代T細胞進行基因編輯

2. 人原代 T 細胞

利用ProteanFect?CRISPRMax Ultra 轉(zhuǎn)染試劑盒（貨號：PT08）對人原代 T 細胞進行基因編輯：采用 TRAC sgRNA/Cas9 蛋白（RNP）轉(zhuǎn)染的方案，結(jié)果如下圖 3 所示。基因組水平檢測（圖2左）顯示人 T 細胞整體 TRAC 突變率達 80.1%，蛋白水平檢測（圖2右）顯示蛋白敲低效率達 85%。

圖3. 使用ProteanFect?CRISPRMax Ultra轉(zhuǎn)染試劑盒對人原代T細胞進行基因編輯

3.iPSC 誘導(dǎo)多能干細胞

來自斯坦福大學的研究團隊利用 ProteanFect?成功遞送 PE7 基因編輯系統(tǒng)至 PBMC 來源的 iPSC，并實現(xiàn)精準點突變（c.757G>T），堿基替換效率達 55%，進一步驗證了該試劑在難轉(zhuǎn)染干細胞中的高效基因編輯能力（圖4）。

圖4. 使用ProteanFect?遞送PE7系統(tǒng)進入iPSC進行基因編輯

四、邁向高效與溫和的基因編輯新時代

隨著精準醫(yī)學和細胞治療的快速發(fā)展，對多種功能細胞進行高效基因編輯的需求正持續(xù)增長。無論是免疫細胞（例如 T 細胞、NK 細胞、巨噬細胞）還是多能干細胞或造血干細胞，其在疾病建模、再生醫(yī)學和新型細胞療法開發(fā)中都占據(jù)核心地位。而像 ProteanFect?這樣的創(chuàng)新遞送技術(shù)，正在為這一廣闊領(lǐng)域注入新的活力。它不僅是一項技術(shù)進步，更代表了一種研究范式的轉(zhuǎn)變——使我們能夠以更溫和、更高效的方式與細胞“對話”，在最大程度保持細胞功能與狀態(tài)的前提下，實現(xiàn)對基因組的精準調(diào)控。

未來已來，基因編輯的大門正因這些關(guān)鍵而細膩的技術(shù)突破越開越大。對于每一位致力于免疫治療、基因工程與再生醫(yī)學的研究者而言，掌握一類高效、安全且適用于多種難編輯細胞類型的遞送工具，或許正是邁向下一代生物醫(yī)學發(fā)現(xiàn)與臨床轉(zhuǎn)化的第一步。

關(guān)于西湖凝聚體

西湖凝聚體生物是專注于核酸遞送領(lǐng)域的國家級高新技術(shù)企業(yè)，已服務(wù)國內(nèi)外大量頂尖高校及科研機構(gòu)。我們成功研發(fā)了全球首個基于哺乳動物內(nèi)源蛋白的凝聚體核酸遞送平臺，為高效基因遞送提供了創(chuàng)新解決方案。

我們的首個產(chǎn)品 ProteanFect?轉(zhuǎn)染試劑系列，顯著提升了原代細胞和難轉(zhuǎn)染細胞系的基因遞送效率，助力全球科研工作者更高效便捷地開展基因研究。同時，我們正與全球藥企和生物技術(shù)公司緊密合作，開發(fā)一系列前沿基因治療臨床產(chǎn)品。歡迎全球研究者和合作伙伴與我們攜手，共同推進更創(chuàng)新、更高性能的基因遞送系統(tǒng)和產(chǎn)品的開發(fā)。

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