寡核苷酸類藥物的1-4類雜質(zhì)及其限度介紹

寡核苷酸的生產(chǎn)通常采用成熟的亞磷酰胺法，通過自動化的固相樹脂化學(xué)合成實現(xiàn)，所使用的起始原料源自受保護(hù)的2'-脫氧核苷（dA、dC、dG、T）、核糖核苷（A、C、G、U）或化學(xué)修飾核苷。寡核苷酸原料藥中的雜質(zhì)來源包括三方面：1）原材料；2）合成過程；3）加工與儲存期間的降解。原材料可進(jìn)一步分為起始物料（如亞磷酰胺、載堿基載體）和其他原材料（如輔助試劑）。水分控制至關(guān)重要，因為水分會與亞磷酰胺反應(yīng)使其失活。按對最終藥品的影響，亞磷酰胺雜質(zhì)可分為三類：1）非反應(yīng)性且非關(guān)鍵雜質(zhì)；2）反應(yīng)性但非關(guān)鍵雜質(zhì)；3）反應(yīng)性且關(guān)鍵雜質(zhì)。此處僅討論第三類雜質(zhì)（反應(yīng)性且關(guān)鍵），因其最終會成為原料藥中的雜質(zhì)。在多數(shù)情況下，這些雜質(zhì)屬于非天然物質(zhì)，因此被寡核苷酸安全工作組（OSWG）2017年白皮書歸為IV類雜質(zhì)。

法規(guī)申報中需說明雜質(zhì)及其產(chǎn)生機(jī)制。盡管在初始IND（investigational new drug，新藥研究申請）/CTA（clinical trial application，臨床試驗申請）提交中，這部分內(nèi)容較為簡略，但隨著研究藥物進(jìn)入臨床開發(fā)階段，需更深入地闡明雜質(zhì)及其來源，并與監(jiān)管機(jī)構(gòu)溝通。

為獲得目標(biāo)寡核苷酸序列，按序列順序在固相樹脂上依次偶聯(lián)，從序列的3'端起始，逐步延伸至5'端。自20世紀(jì)80年代初以來，該合成過程已實現(xiàn)全自動化。鏈組裝完成后，通過從固相載體上切割產(chǎn)物、全局脫保護(hù)，再經(jīng)高效液相色譜（HPLC）、超濾和凍干等下游處理實現(xiàn)分離。在每個工藝步驟中，反應(yīng)不完全或副反應(yīng)可能導(dǎo)致終產(chǎn)物中產(chǎn)生雜質(zhì)。不同的生產(chǎn)工藝會產(chǎn)生不同的雜質(zhì)，因此所采用的生產(chǎn)工藝直接影響雜質(zhì)譜，需對雜質(zhì)進(jìn)行識別、定量，并通過設(shè)定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)加以充分控制。本文結(jié)合2017年寡核苷酸安全工作組（OSWG）白皮書所述指南，對常見雜質(zhì)進(jìn)行分類。

2017年OSWG將寡核苷酸藥物中的雜質(zhì)分為四大類。I–III類為非關(guān)鍵雜質(zhì)，包括代謝產(chǎn)物、母藥序列變體或天然存在的核酸結(jié)構(gòu)修飾，無需在毒理學(xué)研究中額外評估。IV類為關(guān)鍵雜質(zhì)，因其非天然來源，需評估毒理特性；生產(chǎn)工藝應(yīng)最大限度減少IV類雜質(zhì)的生成。

ICH Q11（EMA，2012）指出，雜質(zhì)作為原料藥的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA），可能影響藥品安全性。寡核苷酸雖被排除在ICH Q6A、Q3A（有機(jī)雜質(zhì)）、Q3C（殘留溶劑）之外，但需遵循其原則制定CMC控制策略。

OSWG 2017年白皮書借鑒ICH Q3A的精神，提出了寡核苷酸雜質(zhì)鑒定的決策樹，并建議了單個雜質(zhì)的報告、識別和鑒定閾值雜質(zhì)限度（見下表）。OSWG發(fā)布的另外兩份白皮書也具有重要參考價值：一份探討安全藥理學(xué)評估（Berman等人，2014）；另一份圍繞生殖與發(fā)育毒性評估，為閾值和限度的設(shè)定提供了詳細(xì)依據(jù)（Cavagnaro等人，2014）。這些文件均應(yīng)在制定寡核苷酸治療藥物的CMC控制策略時予以考慮。

高分辨離子對反相LC-MS是原料藥相關(guān)雜質(zhì)CMC控制的核心工具：既可鑒定/定量雜質(zhì)，又可追溯到“工藝步驟”或“起始物料”以確定雜質(zhì)來源。為工藝開發(fā)提供必要信息，以避免或最大限度降低終產(chǎn)品中的雜質(zhì)水平。下游加工中，多數(shù)雜質(zhì)可通過柱色譜去除，但亞磷酰胺起始材料中的雜質(zhì)因與主產(chǎn)物洗脫位置接近，極難（甚至無法）純化去除。此外，這類雜質(zhì)會隨亞磷酰胺在整個序列中的每次摻入而累積，可能達(dá)到臨界水平。例如：若亞磷酰胺砌塊中含0.05%的關(guān)鍵活性雜質(zhì)，在20mer寡核苷酸中摻入5次后，粗品中雜質(zhì)水平可達(dá)0.25%；若起始材料中該雜質(zhì)為0.25%，5次摻入后粗品中雜質(zhì)可升至1.25%。

起始材料的質(zhì)量穩(wěn)定性至關(guān)重要，需在供應(yīng)商或制造商層面嚴(yán)格控制。歐洲制藥寡核苷酸聯(lián)盟（EPOC）（Kiesman等人，2021）已發(fā)布相關(guān)指南。

雜質(zhì)的具體分類

Ⅰ類雜質(zhì)：工藝相關(guān)雜質(zhì)，同時也是母體分子的主要代謝物。因與主要代謝物結(jié)構(gòu)一致，默認(rèn)已完成毒理學(xué)研究。

示例：3'或5'端核苷酸的內(nèi)切核酸酶降解（n-1）、綴合物或連接子的丟失、尿苷通過脫嘧啶的部分/完全降解（下圖所示）、脫嘌呤導(dǎo)致的無堿基位點、2'F基團(tuán)的消除等。

Ⅱ類雜質(zhì)：工藝相關(guān)雜質(zhì)，含核酸中天然存在的結(jié)構(gòu)單元，但屬于修飾后的母體化合物。因結(jié)構(gòu)為內(nèi)源性，通常無安全性擔(dān)憂。

示例：硫代磷酸酯寡核苷酸中的磷酸二酯雜質(zhì)、氧化堿基（下圖所示）、堿基轉(zhuǎn)換、3'端通過環(huán)磷酸酯形成的截短、RNA中5'-2'核苷酸鍵的形成、來自起始材料且天然存在的雜質(zhì)等。

Ⅲ類雜質(zhì)：工藝相關(guān)雜質(zhì)，與母體分子的差異僅在于分子序列，不含新結(jié)構(gòu)單元。潛在毒性可能僅限于序列改變導(dǎo)致的脫靶反義效應(yīng)或免疫刺激（如核苷酸缺失（n-1）、插入（n+1）或替換（如脫氨））。在治療性反義策略中，這類修飾序列的水平通常過低，難以產(chǎn)生藥理效應(yīng)。

示例：內(nèi)部缺失（n-1、n-x）、內(nèi)部插入（n+1、n+x）、胞嘧啶脫氨為尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶脫氨為胸腺嘧啶（下圖所示）等。

Ⅳ類雜質(zhì)：工藝相關(guān)雜質(zhì)，含母體分子及天然核酸中均不存在的結(jié)構(gòu)單元。若其規(guī)格限度超過設(shè)定的鑒定閾值，需在非臨床毒理學(xué)研究中評估安全性。

示例：非天然堿基修飾、骨架修飾部分（如起始材料相關(guān)修飾，下圖所示）、CNET（T堿基與C6-氨基連接子的丙烯腈加合物）、工藝相關(guān)雜質(zhì)、Uny linker相關(guān)雜質(zhì)等。所有未知或無法識別的雜質(zhì)也歸為Ⅳ類。

寡核苷酸雜質(zhì)來源廣泛，有些雜質(zhì)來自核糖和骨架結(jié)構(gòu)，有些則來自堿基。其中，以核糖和骨架結(jié)構(gòu)為例，相關(guān)雜質(zhì)如下表所示。

以堿基為例，相關(guān)雜質(zhì)如下表所示。

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