技術梳理系列 | Genmab的Duomab平臺

DuoBody?是一種多功能的生物技術平臺，用于生成雙特異性抗體，這些抗體能夠產生多種效果，包括同時招募免疫細胞和識別腫瘤細胞。

雙特異性抗體為多種雙重靶向應用提供了一種靈活的解決方案。它們可用于細胞受體的阻斷、激活或下調；可用于招募并靶向T細胞；還可用于協助遞送毒性載荷。

DuoBody?技術平臺

Genmab的DuoBody?是一個經過驗證的技術平臺，用于雙特異性抗體庫的高通量生成和篩選，采用的是雙特異性抗體格式。

DuoBody?平臺技術涉及三個基本步驟，用于生成穩定的雙特異性人源IgG1抗體。首先，分別生產兩個IgG1抗體，每個抗體在第三恒定（CH3）結構域中均含有單一匹配的突變（第409位賴氨酸突變為精氨酸，K409R；第405位苯丙氨酸突變為亮氨酸，F405L），使用重組哺乳動物表達系統進行生產（見下圖，步驟1）。隨后，根據標準的回收和純化流程對這些IgG1抗體進行純化（見下圖，步驟2）。生產并純化后，在特定的實驗室條件下將兩種抗體重新組合，這一過程稱為Controlled Fab-arm exchange，最終以非常高的產量（通常>95%）獲得雙特異性抗體產品（見下圖，步驟3以及生產示意圖）。

DuoBody?生產工藝：生成雙特異性抗體的3個步驟。

通過cFAE生產雙特異性抗體示意圖.圖片來源：doi:10.1038/nprot.2014.169

DuoBody?工藝既可以在發現規模上輕松進行，也可以擴展到商業生產規模（見下圖）。

DuoBody?平臺采用的簡單后生產交換反應，可用于生成雙特異性抗體庫。X和Y代表抗體庫。X+Y是需要進行的生產次數，而X×Y是在發現過程中生成的不同雙特異性組合的數量。

如有需要，可以采用簡單的精制步驟來獲得本質上純凈的DuoBody?產品。重要的是，通過DuoBody?平臺生成的雙特異性抗體完全保留了IgG1的結構和功能（見下圖）。

數據來源：doi/10.1073/pnas.1220145110

此外，DuoBody?平臺還兼容額外的Fc工程突變，以滿足特定應用的需求。DuoBody?平臺的便捷性和多功能性也已擴展到小鼠（和大鼠）抗體，從而可以通過Controlled Fab-arm exchange高效生成替代性的雙特異性小鼠IgG1、IgG2a和IgG2b（以及大鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG2c分子）（見下圖）。

數據來源：DOI:10.1038/s41598-017-02823-9

DuoBody?平臺的生物學意義

DuoBody?平臺基于對抗體自然生物學的深入理解，旨在創造創新的治療方法。

DuoBody?平臺的靈感來源于對IgG4 Fab臂交換這一自然發生過程的廣泛了解。要理解Fab臂交換的過程，回顧人免疫球蛋白G（IgG）抗體的結構組成至關重要。人IgG抗體分為四個亞類：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，它們具有不同的結構和功能特性。大多數IgG亞類是對稱的，包含兩個相同的抗原結合位點，因此這些抗體是單特異性的（即只能結合一種特定的表位）。人IgG4分子也是由B細胞產生的單特異性抗體。然而，一旦它們被B細胞分泌后，就可以參與一種獨特的Fab臂交換過程，在此過程中它們會變成雙特異性的。這一動態且隨機的過程涉及從一個IgG4抗體中重組Fab臂（由一條重鏈與一條輕鏈結合而成），與另一個IgG4抗體的Fab臂進行交換。因此，形成了具有不同抗原特異性的Fab臂的IgG4抗體。

人體內的所有IgG4分子都參與了這種自然發生且持續不斷的Fab臂交換過程。在人類中，能夠參與Fab臂交換是IgG4所固有且獨特的特性。有趣的是，雙特異性抗體因此在人體免疫中自然產生。基于對IgG4 Fab臂交換的機制的廣泛研究，發現鉸鏈區和CH3結構域在Fab臂交換中都起著關鍵作用。更具體地說，鉸鏈區第228位的絲氨酸（S228）和CH3結構域第409位的精氨酸（R409）（見下文）被證實是允許IgG4抗體參與Fab臂交換的關鍵氨基酸殘基。

鉸鏈區第228位的絲氨酸（S228）是允許IgG4抗體參與Fab臂交換的關鍵氨基酸殘基

• 體外實驗：在存在GSH的情況下，野生型IgG4（如IgG4-EGFR和natalizumab）發生了Fab臂交換，而含有S228P突變的IgG4（如IgG4S228P-EGFR）則沒有發生交換。

IgG4-CD20與IgG4-EGFR（a、f）、IgG4S228P-EGFR（b、g）、natalizumab（c、h）、gemtuzumab（d、i）和TGN1412（e、j）。數據來源：DOI: 10.1038/nbt.1553

• 體內實驗：只有含有野生型IgG4分子的混合物（如IgG4-EGFR和natalizumab）在小鼠血液中產生了雙特異性抗體，而含有S228P突變的IgG4（如IgG4S228P-EGFR）或IgG1分子的混合物則沒有產生雙特異性抗體。

IgG4-CD20/IgG4-EGFR（開放圓圈）、IgG4-CD20/IgG1-EGFR（開放正方形）、IgG4-CD20/IgG4S228P-EGFR（閉合圓圈）、IgG4-CD20/natalizumab（閉合正方形）和IgG4-CD20/gemtuzumab（閉合三角形）。數據來源：DOI: 10.1038/nbt.1553

• 藥代動力學模型中的S228P突變：S228P突變通過穩定核心鉸鏈區，顯著減少了治療性IgG4抗體與內源性IgG4之間的Fab臂交換，從而提高了藥物的穩定性和安全性。

數據來源：DOI: 10.1038/nbt.1553

CH3結構域第409位的精氨酸（R409）是人類 IgG4 發生 Fab 臂交換的關鍵 CH3 決定因素

• 解離常數（KD）：通過CH3-CH3相互作用的KD值看出，IgG4的KD值約為4.8×10^-8 M，而IgG4-R409K的KD值約為8.0×10^-9 M，表明R409K突變顯著增強了CH3-CH3的相互作用。只有當CH3–CH3相互作用足夠弱時，才會發生高效的Fab臂交換。

數據來源：DOI: 10.4049/jimmunol.1003336

• Fab臂交換效率：在體外實驗中，野生型IgG4在24小時內可達到約50%的雙特異性抗體生成效率，而R409K突變體則無法檢測到雙特異性抗體的生成。

數據來源：DOI: 10.4049/jimmunol.1003336

• 體內實驗結果：在小鼠模型中，注射IgG4-EGFR和IgG4-CD20混合物后，3小時即可檢測到雙特異性抗體，24小時達到峰值，表明IgG4在體內也能發生Fab臂交換。

基于以上對IgG4 Fab臂交換機制的深入理解，Genmab開發出了用于生成穩定雙特異性IgG1抗體的強大平臺：DuoBody?平臺。

自主思考時間

IgG4的Hinge區的S228和CH3結構域的R409與IgG1的結構差異？

Hinge區：IgG1的鉸鏈區在第228位為脯氨酸（P228），其環狀結構限制了多肽鏈主鏈的自由旋轉，賦予了鉸鏈區更高的剛性和穩定性，從而限制了二硫鍵的靈活性，使得IgG1鉸鏈區結構更為穩固。相比之下，IgG4在該位點為絲氨酸（S228），其較小且極性的側鏈使鉸鏈區更加靈活，易于發生鏈間二硫鍵的解離和重組，進而促進Fab臂的交換。因此，IgG1抗體由于P228帶來的剛性結構特點，表現出更高的穩定性且不會發生Fab臂交換，更適合用于開發穩定的單特異性抗體藥物。

CH3結構域：在IgG的CH3結構域中，重鏈界面之間存在著多種非共價相互作用力，包括疏水作用（例如F405、L368、V397等形成的疏水核心）、氫鍵（例如谷氨酰胺Q347、蘇氨酸T366等構成的氫鍵網絡）以及靜電相互作用。IgG1的CH3結構域在409位為賴氨酸（K409），通過穩定的靜電相互作用增強了CH3結構域界面的緊密結合；而IgG4的409位為精氨酸（R409），其較長且帶正電荷的側鏈增加了CH3結構域界面間的靜電排斥，破壞了界面的穩定性，從而促進了IgG4 Fab臂交換的發生。

基于Genmab的Duobody平臺上市的雙特異性抗體藥物

Teclistamab（商品名：Tecvayli?）

原研單位：強生公司（Johnson&Johnson）

靶點：BCMA和CD3。

BCMA：B細胞成熟抗原，主要在惡性漿細胞和正常漿細胞中高表達，是治療多發性骨髓瘤的重要靶點。

CD3：T細胞表面的膜抗原，與T細胞抗原識別受體（TCR）結合，激活T細胞，實現T細胞重定向。

上市時間

? 歐盟：2022年8月25日。

? 美國：2022年10月25日。

? 中國：2024年6月18日。

適應癥：Teclistamab主要用于治療復發或難治性多發性骨髓瘤（R/R MM）成人患者。

Epcoritamab（Epkinly?）

原研單位：艾伯維與Genmab達成協議，共同開發和商業化epcoritamab。

靶點：CD20和CD3

CD20（B細胞表面抗原CD20）主要在成熟B細胞上表達，調控其激活、分化和增殖，并參與B細胞受體（BCR）信號通路的調控，是B細胞淋巴瘤和白血病等惡性腫瘤的重要治療靶點，而在前B細胞和漿細胞上則不表達。

上市時間

? 美國：2023年5月19日，FDA批準Epcoritamab（Epkinly）上市。

? 日本：2023年9月，Epcoritamab在日本獲批。

? 歐洲：2023年9月，Epcoritamab在歐洲EMA獲批。

適應癥

Epcoritamab在美國、日本和歐洲均獲批用于治療接受過兩線及以上系統治療后復發或難治性的彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）及相關亞型患者，其中美國還批準其用于濾泡性淋巴瘤（FL）患者。

Amivantamab（Rybrevant?）

原研單位：楊森生物（Janssen Biotech，強生公司旗下）與Genmab合作開發。

靶點：EGFR和c-MET。

EGFR（表皮生長因子受體）：是一種酪氨酸激酶受體，廣泛表達于多種細胞類型中，參與細胞增殖、分化和存活等生物學過程。在多種癌癥（如肺癌、結直腸癌等）中，EGFR基因突變會導致其異常激活，從而促進腫瘤細胞的生長和存活。

c-MET（間充質上皮轉化因子）：是一種受體酪氨酸激酶，參與細胞增殖、遷移和存活等過程。c-MET基因的異常激活（如擴增、突變或過表達）在多種癌癥（如肺癌、胃癌、肝癌等）中較為常見，與腫瘤的侵襲性和預后不良密切相關。

上市時間

? 2021年5月21日，美國FDA批準Amivantamab（商品名Rybrevant）上市。

? 2025年2月，Amivantamab在中國獲批上市。

適應癥

Amivantamab主要用于治療攜帶EGFR外顯子20插入突變或EGFR exon19del/L858R突變的局部晚期或轉移性非小細胞肺癌（NSCLC）患者，包括單藥治療經鉑類化療進展的患者，以及聯合卡鉑和培美曲塞用于一線治療或特定突變經EGFR-TKI治療進展的患者。

Talquetamab（Talvey?）

原研單位：強生公司（Johnson&Johnson），由其旗下楊森制藥（Janssen Pharmaceuticals）開發。

靶點：GPRC5D和CD3

GPRC5D（G蛋白偶聯受體C類5成員D）是一種在多發性骨髓瘤（MM）細胞中高表達的孤兒受體，主要在毛囊等硬角化組織中表達，其激活可促進細胞增殖、生存和遷移，與MM患者的不良預后相關。

上市時間

? 2023年8月：美國FDA加速批準Talquetamab（商品名：Talvey）上市。

? 2023年8月：歐盟委員會有條件批準Talquetamab上市。

? 2024年7月：在韓國獲批上市。

? 2025年2月：在中國獲批上市。

適應癥

Talquetamab獲批用于治療既往接受過至少三線治療（包括蛋白酶體抑制劑、免疫調節劑和抗CD38抗體）的復發或難治性多發性骨髓瘤（R/R MM）成人患者。

總結

基于Genmab的Duobody平臺開發的雙特異性抗體藥物在腫瘤治療領域取得了顯著進展，已有4款藥物獲得FDA批準上市，分別針對不同的腫瘤靶點，為患者提供了新的治療選擇。

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