關于中藥含藥血清，你想知道的都匯總好了，請查收！涉及動物選擇、給藥方式和采血時間怎么確定

情景重現

中醫藥科研項目正在快速發展，但因為中藥成分復雜，一般SCI發表都會要求對中藥進行成分表征，或做中藥原液、或檢測入血成分，以確定可能發揮藥效的物質基礎。

那么，如何來制備中藥的含藥血清，血清中的成分又是用什么方法檢測呢？我們本次將前期的一些推文匯總，向大家匯報：

1.

1.1實驗動物的選擇

采用正常動物或模型動物的血清均有，并且采用健康正常動物應盡量與模型動物一致。因此，選擇健康動物還是模型動物需要進一步探討。

1.2給藥方案的選擇

（1）給藥劑量：若將含藥血清看作一種藥物，那么給藥劑量取決于2 個方面：一是動物給藥量，二是培養體系或反應體系中含藥血清濃度。動物給藥量換算公式為給藥劑量＝人臨床用量×動物等效劑量比值×培養液中血清稀釋度，如果是做入血成分分析，可以適當提高給藥劑量（5-10倍臨床劑量換算）。

（2）給藥、采血時間：目前有幾種經驗給藥方案：1）7～10 d 給藥法（每天 1 次，連續給藥 7～10 d）；2）3 次給藥法（連續 3 次，第 1、2 次間隔 20 h，第 2、3 次間隔 4 h）；3）2 次給藥法（第 1 次給藥后 2 h，再以相同劑量重復給藥 1 次）等。采血時間一般在末次給藥后 0.5～3 h，一般不超過 6 h，采血時間過早，部分藥物組分未被吸收入血；采血時間過長，部分藥物組分在體內發生轉化或被排泄掉，理想的采血時間應落在藥物達到穩態血藥濃度期間。

1.3血清的處理

大部分研究人員對含藥血清采用 56 ℃水浴加熱 30 min的滅活方式，可以除去血清本身含有的補體等干擾實驗的活性成分；也有研究人員將含藥血清經乙醇、丙酮等有機試劑處理，通過使蛋白質變性去除血清中的酶、激素等，從而保留藥物本身的作用。

具體可見往期公眾號推文：《

2.中藥含藥血清制備及成分鑒定流程：

制備流程見下圖：

看了流程圖，下面我們再來學習下入血成分-代謝組檢測相關的實驗方法：

1.從血清樣品中提取代謝物

血清樣品在4°C下解凍后，將200μL血清與預冷卻的800μL甲醇混合，并將上清液在4°C下以20000 g離心10分鐘。上清液通過0.22μm濾膜過濾，獲得待測樣品。

2.UHPLC-MS/MS的色譜和質譜條件

使用Thermo Scientific UltiMate 3000 HPLC和ACQUITY UPLC T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm），自動進樣器溫度為8°C，流速為0.3 mL/min，柱溫為50°C。用2μL的進樣體積洗脫樣品。流動相由0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈溶液（B）組成。梯度洗脫程序為0-0.8min，2%b；0.8-2.8分鐘，2%-70%B；2.8-5.6分鐘，70%-90%B；5.6–8分鐘，90%–100%；8-8.1分鐘，100%-2%b；8.1–10分鐘，2%b。Thermo Q Exactive Focus質譜儀在以下條件下運行：電噴霧離子（ESI）源、正負離子模式、正離子噴霧電壓4.00 kV、負離子噴霧電壓3.00 kV、鞘氣體35 Arb、輔助氣體10 Arb、毛細管溫度320°C、全掃描分辨率70000、掃描等離子體芯比范圍70–1050、HCD二次裂解、，碰撞電壓為30eV。

3.數據處理

使用MassHunter Profider軟件（版本B.06.00；美國加利福尼亞州圣克拉拉市，安捷倫）提取樣本數據進行分析和比較。根據人類代謝組數據庫（HMDB）和METLIN的精確分子量確定了潛在的生物標志物(http://metlin.scripps.edu/)數據庫。通過MetaboAnalyst 4.0進行代謝途徑富集分析(http://www.metaboanalyst.ca/)網站。

本次推文再分享：文章Feiyiliu Mixture sensitizes EGFRDel19/T790M/C797S mutant non-small cell lung cancer to osimertinib by attenuating the PRC1/Wnt/EGFR pathway

3.含藥血清制備，如何判斷質量可靠！

3.1.肉眼觀察一般情況：我們可以采用不同品系的動物制備血清/血漿，給完藥取血后，不溶血的情況下，應該是如下：一般血清是略偏黃色，如果變紅那可能就是有點溶血，但是輕微溶血對于成分鑒定和細胞實驗是沒有影響的。

3.2.開展入血成分鑒定：如果肉眼觀察無異常后還是不放心，那就做液質聯用成分鑒定，看看是否含有自己方子里面的成分。

4.中藥成分及入血成分如何檢測

中藥作為多組分復雜體系，具有成分繁多、結構多樣、含量差異大、異構體豐富等特點，定性分析面臨著很大的挑戰。傳統色譜技術（薄層色譜、液相色譜等）的本質是利用各成分在流動相和固定相中的分配能力差異而表現出的不同分離特性（薄層色譜為比移值Rf = 溶質移動的距離/溶液移動的距離，氣相色譜和液相色譜為保留時間Rt）。當色譜分離條件固定時，上述分離特性為固定值，因此可通過與對照品的Rf或Rt值進行比較，判斷樣品是否含有某一化合物。此類方法具有設備價格相對較低、操作簡單、結果易讀等特點，因而廣泛用于中藥材及飲片、中成藥、中藥提取物等的質量控制。然而，上述方法需要通過與對照品進行比對才可對化合物進行定性，因此，對未知成分的定性能力很差，無法滿足當前全面闡明中藥化學組成的需求。

2020年，國家藥監局發布《關于促進中藥傳承創新發展的實施意見》，明確提出要“引入新工具、新方法、新技術”，深入挖掘中醫藥寶庫的科學內涵。液相色譜-高分辨質譜聯用技術不僅兼顧了色譜分離特性，還增加了質譜維度信息（母離子質荷比、子離子質荷比、同位素分布）等，極大提高了鑒定結果的準確度，避免了常規色譜定性因保留時間相同導致的假陽性；此外，可通過母離子質荷比、子離子質荷比等信息對無對照品的化合物進行定性，因而極大拓展了常規色譜技術對未知成分的定性能力，定性結果往往可達到100+。

這里我們分享一篇phytomedicine文章：Integrated serum pharmacochemistry and network pharmacology toexplore the mechanism of Yi-Shan-Hong formula in alleviating chronicliver injury（血清藥物化學與網絡藥理學相結合探討Yi-Shan-Hong formula減輕慢性肝損傷的作用機制）

本文采用專業的液質技術，將中藥成分和入血成分進行鑒定，匯總表格包含了成分、荷質比、碎片m/z、成分歸屬等。

與一般非靶的方式做中藥成分鑒定或入血成分不同，目前發2區以上文章，我們建議采用專業中藥自建數據庫，并進行分析。

中藥成分分析是中藥物質基礎的重要組成部分，目前以網藥、生信、組學為橋梁研究作用機制的高分思路，均需要中藥成分鑒定為基礎。

1).中藥藥效物質篩選；

2).確定中藥質量標志物；

3).以入血成分或中藥成分鑒定為基礎的網絡藥理；

4).代謝組學分析篩選途徑靶點；

。。。。。。

5.如何確定中藥成分是否是有效成分

這里要告訴您一個事實，那就是做成分鑒定是不能確定有效成分。只能說明該中藥提取物里面含有這些成分。這些成分可以作為中藥發揮藥效的預測，就是可能是發揮作用。您可以通過網藥預測，或者進一步做入血成分確定其中的可能的有效成分。

那如何確定中藥成分的有效性：

1.根據成分鑒定的結果，然后結合文獻，確定某個成分是否對研究的疾病有效；

2.做細胞或動物實驗篩選有效物質；

3.采用生信（網絡藥理）或組學（代謝組學）的方法，預測可能的有效成分或代謝物，找到有效標志物。

還是把這張圖放上，或許對您有些啟發~

6.入血成分鑒定、含量測定、指紋圖譜與非靶代謝組的區分

入血成分鑒定：通過UPLC-MS/MS等方式比較中藥原液與動物給藥后的含藥血清中成分，確定哪些成分是入血前后都有的單體成分。

非靶代謝組：與入血成分鑒定的方法相似，通過UPLC-MS/MS等方式比較中藥原液與動物給藥后的血清、尿液、糞便、組織中的成分，并通過比對公共數據庫，進行富集分析，獲得通路途徑。

含量測定：相關公司叫做靶向代謝組檢測；這個主要就是采用液相或者液質，對已知的成分購買標準品，制作標準曲線，并摸索流動相比例，將目標成分分離度調整好，最終確定中藥液或者含藥血清等樣本里面的成分多少，是一個明確的含量值，有單位。

指紋圖譜：指某些復雜物質，比如中藥，某種生物體或某種組織或細胞的DNA，蛋白質經適當處理后，采用一定的分析手段（如液相、液質等），得到的能夠標示其化學特征的色譜圖或光譜圖。主要原則是系統性、特征性、穩定性。有的研究會用到：中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，以計算相似度等。

7.中藥成分及入血成分鑒定找誰做：

相關咨詢，加微信：1278317307。

中醫藥基礎科研服務：

相關咨詢，加微信：1278317307。

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