復方2區！雙柏連合劑通過PI3K-Akt-Bcl2信號通路增強順鉑的抗癌療效

本期推薦的是由汕頭市惡性腫瘤基礎與轉化研究重點實驗室、浙江中醫藥大學、汕頭市中心醫院等研究團隊合作近期發表于

Journal of Ethnopharmacology

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Shuang Bailian mixture enhanced the anti-cancer effect of cisplatin by regulating PI3K-Akt-Bcl 2 signaling pathway

民族藥理學相關性：

食管癌（EC）是一種常見的惡性腫瘤，具有預后差和臨床死亡率高的特點。順鉑（CP）作為一線化療藥物，面臨著耐藥性的挑戰，這制約了其臨床療效。近幾十年來，傳統中藥作為化療輔助劑的潛力日益受到關注。在我們的臨床實踐中，雙柏連合劑（SBLM）能顯著增強CP的抗癌作用。然而，SBLM的潛在作用機制仍需進一步研究。

目的

本研究旨在探討SBLM增強CP抗癌作用的潛在機制。

方法

本研究采用網絡藥理學和分子對接技術獲取SBLM的潛在活性靶點。此外，采用CCK-8實驗、傷口愈合實驗、集落形成實驗、流式細胞術和蛋白質印跡法（Western blotting）評估SBLM增強CP抗癌作用的特性。進一步地，利用裸鼠移植瘤模型來進一步確定SBLM增強CP抗癌作用的潛在機制。

結果

網絡藥理學分析表明，PI3K-Akt-Bcl-2信號通路是SBLM的主要作用靶點。此外，SBLM能顯著提高CP的抗癌效果，包括抑制細胞增殖、抑制集落形成和侵襲、誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡。而且，與單獨使用SBLM或CP治療相比，SBLM + CP聯合用藥能顯著減小荷瘤小鼠的腫瘤體積。從機制上講，SBLM能夠通過PI3K-Akt-Bcl-2信號通路誘導癌細胞凋亡，從而增強CP的療效。

結論

我們的研究揭示了SBLM通過抑制PI3K/Akt/Bcl-2信號通路誘導細胞凋亡，從而增強CP抗癌作用的潛在機制。這些結果表明，SBLM有望成為食管癌化療方案中一種有前景的輔助藥物。

圖文摘要

【前言】

食管癌（EC）是一種常見的惡性腫瘤，其早期癥狀通常隱匿，導致臨床早期診斷面臨挑戰。根據國際癌癥研究機構（IARC）2022年發布的最新國家癌癥統計數據，食管癌在全球最常見確診癌癥中位列第11位，在癌癥相關死亡原因中位列第七位，估計每年新增約51.1萬例病例，并導致約44.5萬人死亡。由于具有發現晚、死亡率高和預后差的特點，食管癌給全球范圍內的經濟和人群健康帶來了沉重負擔。

化療在臨床實踐中仍是食管癌的關鍵治療策略。然而，作為食管癌一線化療藥物的順鉑（CP），常常面臨疾病復發、耐藥性、毒性及副作用的挑戰，這限制了其臨床應用。近幾十年來，越來越多的研究表明，中藥（包括純化合物、總提取物和復方）能夠有效提高5-氟尿嘧啶（5-FU）、紫杉醇和順鉑等化療藥物的療效，同時降低其耐藥性、毒性和副作用。這種互補性方法為改善癌癥治療結局和患者耐受性提供了一種有前景的策略。據文獻報道，阿帕替尼、樺木酸等藥物與順鉑聯合使用，顯著增強了食管癌治療中的化療敏感性。各種靶向藥物或天然活性成分能夠通過不同的信號通路抑制食管癌細胞的增殖、誘導凋亡并使細胞周期停滯。將這些藥物與順鉑聯用，不僅能增強治療效果，也為食管癌的治療提供了一種有前景的方法。

雙柏連合劑（SBLM，批準文號：20070031，經廣東省藥品監督管理局批準）是根據中醫理論研發、由汕頭市中心醫院開發的復方草藥制劑，作為院內制劑在本院用作化療藥物的輔助治療已超過二十年，在結直腸癌、食管癌和胃癌等多種惡性腫瘤中顯示出顯著的抗癌效果。SBLM 由半枝蓮、白花蛇舌草、兩面針和白英組成，這些藥材在臨床上均以安全有效著稱。然而，SBLM 的潛在作用機制仍不明確，需要進一步研究來闡明其增強化療藥物抗癌特性的潛在效應。

本研究旨在通過結合網絡藥理學、分子對接和實驗驗證的綜合方法，闡明雙柏連合劑（SBLM）在增強順鉑（CP）抗食管癌療效中的治療機制。我們的主要目標是確定 SBLM 在食管癌中的潛在分子靶點，并理解這些靶點在與 CP 聯合使用時如何協同增強抗癌效果。我們應用網絡藥理學分析來剖析 SBLM 如何通過 PI3K/Akt/Bcl-2 信號通路（該通路在食管癌的發病機制中起核心作用）內的復雜相互作用發揮其抗腫瘤作用。此外，我們利用分子對接來預測 SBLM 主要成分與其靶蛋白之間的結合位點，為后續的實驗研究提供理論基礎。為了驗證我們的計算結果，我們采用了食管癌細胞系 KYSE 30 和 KYSE 140，以及荷瘤裸鼠模型，來探索 SBLM 增強 CP 抗癌特性的潛在機制。這種綜合方法不僅為 SBLM 的分子機制提供了新的見解，也為開發更有效的食管癌治療策略提供了框架。

【結果部分】

1.網絡藥理學揭示了SBLM治療食管癌的潛在靶點。

圖1. 網絡藥理學揭示SBLM治療食管癌的潛在靶點。(A) 從所選數據庫中獲取的與食管癌相關的基因。(B) SBLM活性成分與食管癌靶點的交集。(C) 通過PPI分析確定SBLM治療食管癌的前15個核心靶基因。(D&E) SBLM治療食管癌的KEGG和GO通路富集分析。

2.主要活性成分與潛在靶點的分子對接。

圖2. 主要化合物與潛在靶點的分子對接。(A) SBLM中主要化合物與PI3K蛋白（PDB ID: 3APC）的結合位點。(B) SBLM中主要化合物與AKT蛋白（PDB ID: 3D0E）的結合位點。(C) SBLM中主要化合物與Bcl-2蛋白（PDB ID: 8HTR）的結合位點。

3.SBLM 抑制了食管癌（EC）細胞的增殖和遷移。

圖3. SBLM抑制食管癌細胞增殖與遷移。(A) 采用CCK-8法檢測SBLM對KYSE 30和KYSE 140細胞的有效作用濃度。(B-E) 通過集落形成實驗評估CP、SBLM及CP+SBLM對細胞增殖的影響。(F) 通過傷口愈合實驗評估CP、SBLM及CP+SBLM對細胞遷移的影響

4.SBLM 增強了順鉑（CP）誘導食管癌（EC）細胞凋亡的效果。

圖4. 雙柏連合劑增強順鉑誘導食管癌細胞凋亡的效應。(A&B) 采用PI染色通過流式細胞術檢測SBLM對細胞周期的影響。(C&D) 采用Annexin V/7-AAD雙染色評估SBLM對細胞凋亡的影響。實驗條件為：KYSE 30細胞使用8 μg/mL SBLM，KYSE 140細胞使用30 μg/mL SBLM。細胞實驗中CP的使用濃度為10 μg/mL。

5.在體外，SBLM 通過調控 PI3K-AKT-Bcl-2 信號級聯反應增強了順鉑（CP）誘導的細胞凋亡。

圖5. 在體外，SBLM通過調控PI3K-AKT-Bcl-2信號級聯增強順鉑誘導的細胞凋亡。(A) 使用JC-1檢測試劑盒測定線粒體膜電位水平。CCCP作為陽性對照用于誘導線粒體膜電位降低。綠色熒光表示線粒體膜電位（MMP）降低，紅色熒光表示正常生理狀態下的線粒體膜電位。(B&C) 通過蛋白質印跡法分析CP、SBLM及CP+SBLM對KYSE 30細胞中相關蛋白的表達影響。(D&E) 通過蛋白質印跡法分析CP、SBLM及CP+SBLM對KYSE 140細胞中相關蛋白的表達影響。蛋白質印跡全膜圖見圖S4和圖S5。比例尺：100 μm。

6.在體內，SBLM 通過調控 PI3K-AKT-Bcl-2 信號級聯反應增強了順鉑（CP）誘導的細胞凋亡。

圖6. 在體內，SBLM通過調控PI3K-AKT-Bcl-2信號級聯增強順鉑誘導的細胞凋亡。(A) 實驗終點時荷瘤小鼠移植瘤模型照片。(B) 各組腫瘤實物尺寸對比。(C) 不同時間點腫瘤體積變化折線圖。(D) 腫瘤組織的H&E染色和免疫組化染色結果。(E&F) 各組細胞凋亡相關蛋白表達的蛋白質印跡分析。蛋白質印跡全膜圖見圖S6。

【結論與討論】

綜上所述，本研究結果揭示了雙柏連合劑在食管癌治療中的潛在作用機制。SBLM能夠通過調控PI3K-AKT-Bcl-2信號通路，在體內和體外實驗中顯著增強順鉑的抗癌效果，從而誘導癌細胞凋亡。本研究也凸顯了中藥在臨床實踐中增強化療藥物療效的應用價值。中藥治療與化療相結合，可能成為腫瘤治療中一種有價值的策略。

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