中藥單體Adv Sci-IF14.1 | 廣中醫團隊揭示連翹酯苷E靶向進巨噬細胞M2極化減輕肝損傷機制

目前針對膿毒癥相關肝損傷的治療策略主要依賴于抗生素治療和支持性護理，但其在從根本上逆轉炎癥反應和代謝失調方面效果有限。天然產物通過多種機制在治療炎癥方面發揮著重要作用，尤其在調節炎癥通路、抑制氧化應激以及平衡免疫反應方面展現出顯著潛力。例如，去亞甲基小檗堿能夠通過抑制NF-κB和MAPK信號通路來減輕肝臟炎癥，并且還能通過抑制肝星狀細胞的激活發揮抗纖維化作用。 因此，探索具有多種作用機制的天然藥物已成為一個新的研究方向。連翹，一種經典的傳統中藥（TCM），具有廣譜的抗炎和免疫調節特性，其連翹酯苷（如連翹酯苷A、B）顯示出良好的保肝療效。 然而，目前的藥理學研究主要集中在連翹酯苷 A 和 B 上，而連翹酯苷 E（FE）的抗炎機制尚未完全明了。

2025年11月14日，廣州中醫藥大學張帆/劉中秋/王彩艷教授團隊在Adv Sci（IF 14.1）發表題為“Forsythoside E Alleviates Liver Injury by Targeting PKM2 Tetramerization to Promote Macrophage M2 Polarization”的文章。FE 介導的 PKM2 四聚體化誘導了巨噬細胞的代謝重編程，同時抑制 STAT3 的磷酸化，從而減少 NLRP3 的轉錄激活，減輕膿毒癥引起的肝臟損傷。

摘要

膿毒癥引發的肝臟損傷與膿毒癥患者的不良預后密切相關。在本研究中，通過包括高通量虛擬篩選、靶點捕獲技術以及原子力顯微鏡（AFM）分析在內的綜合方法，連翹酯苷E（FE）首次被確認為一種新型的丙酮酸激酶 M2（PKM2）的別構激活劑，能夠促進四聚體的形成。通過構建突變蛋白并結合動態光散射（DLS）和熒光共振能量轉移（FRET）技術，發現 FE 與 PKM2 的 K311 結合，從而促進四聚體的形成。利用Seahorse XF 代謝分析儀、實時單細胞多模式分析系統和轉錄組測序技術，發現 FE 介導的 PKM2 四聚體化在巨噬細胞中誘導代謝重編程，同時抑制 STAT3 的磷酸化以及隨后的 NLRP3 轉錄激活。體內評估表明，FE 未表現出明顯的多器官毒性。FE 通過促進巨噬細胞向 M2 抗炎表型的極化來減輕膿毒癥引發的肝臟損傷。通過在小鼠體內特異性過表達具有 WT/K311A 突變的 PKM2 基因，進一步驗證了 FE 的作用機制。綜合來看，本研究闡明了 FE 通過靶向 PKM2 四聚體化來減輕膿毒癥相關肝損傷的分子機制，并提出了針對膿毒癥相關肝損傷治療的創新性代謝-表觀遺傳協同調節策略。

虛擬篩選用于獲得促進PKM2四聚化的潛在化合物

為了找到能夠抑制PKM2二聚體形式并促進其四聚化的小分子化合物，采用基于結構的虛擬篩選策略，針對PKM2的激動劑結合位點篩選了超過30,000個小分子化合物（圖 2B）。根據對接評分，最終選擇了前四種化合物（圖 2C）。分子結合構象與蛋白質的視覺檢查顯示，所有四種化合物都可以與PKM2的激動劑結合位點結合。蛋白質的A鏈和B鏈分別用藍色和綠色卡通結構表示，黃色虛線表示氫鍵（圖 2D）。

雙探針靶點垂釣及相互作用實驗證實FE直接靶向PKM2

為了進一步確認FE是否直接靶向PKM2，我們通過添加生物素標簽和光親和標簽對FE進行化學修飾(圖 4A)，并進行了靶標捕獲實驗(圖 4B)。銀染顯示在55到70 kDa之間有一個明顯的條帶(圖 4C)，LC-MS分析鑒定出與PKM2相關的肽段(圖 4D)。隨后的 pull-down 實驗證明生物素標簽的FE可以直接結合到PKM2蛋白(圖 4E)。同樣，光親和標簽的FE也能夠捕獲PKM2蛋白(圖 4F–H)。免疫熒光結果顯示FE在細胞質中與PKM2共定位(圖 4I) 與 FE 相比，兩種探針抑制了 iNOS 蛋白的表達水平，表明這兩個標簽沒有影響 FE 的抗炎效果 (圖 4J)。此外，CETSA 和 DARTS結果表明，FE 顯著增強了 PKM2 蛋白的穩定性 (圖 4K,L)。為了進一步評估 FE 與 PKM2 蛋白之間的結合親和力，我們進行了SPR 實驗。結果表明，PKM2 與 FE 之間的結合親和力為 277 nM，表明 FE 可以直接且有效地結合到 PKM2 上 (圖 4M)。分子動力學模擬結果表明，FE 結合到 PKM2 四聚體上減少了 RMSD 和 RMSF，表明 FE 增強了 PKM2 四聚體的穩定性 (圖 4N,O這些研究結果共同證實，FE 直接靶向并結合 PKM2。

PKM2 K311 是調節 FE 結合的關鍵氨基酸

為了進一步確認FE在PKM2蛋白上的結合位點，基于FE和PKM2之間的分子對接結果，我們假設PKM2的K311可能是關鍵的氨基酸。PKM2 K311的保守性分析顯示，這個位點在多種物種中是保守的(圖 5A,B)。將這個位點突變成丙氨酸并獲得重組蛋白后，我們進行了CETSA實驗，結果表明，與野生型（WT）蛋白相比，FE無法有效提高突變蛋白的熱穩定性(圖 5C)。我們在細胞中過表達了PKM2 WT和PKM2 K311A蛋白，并檢查了PKM2的多聚形式。結果表明，FE無法有效增加PKM2 K311A四聚體的表達(圖 5D). 為了進一步評估該突變是否削弱了FE和PKM2的結合，AFM顯示FE和PKM2 K311A之間的結合力顯著降低（圖5E–H）。同時，MST結果表明，FE與PKM2 K311A結合的KD值顯著高于PKM2 WT（圖5I,J）。DLS結果表明，FE有效增大了PKM2 WT的顆粒尺寸（圖5K），FRET實驗確認FE促進了PKM2 WT的聚集（圖5M）。然而，這些效應在PKM2 K311A中未觀察到（圖5L,N），表明該位點的突變降低了FE促進PKM2四聚體化的能力。分子動力學模擬顯示，FE沒有減少PKM2 K311A四聚體的RMSD和RMSF（圖 5O,P）。這些結果共同證明PKM2 K311介導FE與PKM2的結合。

結論

本研究系統地闡明了FE通過PKM2 tetramerization介導的代謝重編程和表觀遺傳調控的雙重機制緩解膿毒癥引起的肝損傷的機制。這不僅為FE的臨床應用提供了實驗依據，還為針對免疫代謝調節的膿毒癥治療策略開辟了新的途徑

https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202514514

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