張澤民院士經典綜述！單細胞測序下的腫瘤免疫治療！

免疫浸潤是一整套知識體系，是一種邏輯思維的方式，一旦擁有這種嶄新的角度，作為醫生，我們將能從更深刻地維度去認識腫瘤，去診治病人。我們有幸讀到一篇免疫浸潤的綜述，內容系統，思路條理，邏輯層層遞進，非常值得果友們學習；更幸運的是，果友們積極參與綜述翻譯，并順利完成任務。感謝果友們的支持和參與。這篇論文是多位果友參與完成，愿果友們反復閱讀，仔細推敲琢磨，留言討論，或查閱參考文獻。如果您覺得翻譯得好，受益匪淺，也可以打賞（感謝果友支持），所有收益將分發至參與翻譯的果友們！再次感謝果友們。

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根據綜述主要內容，我們將綜述分為上篇——免疫治療和下篇——免疫浸潤。對于從事腫瘤臨床診治和研究的醫生來說，盡管這篇綜述對于腫瘤免疫的基礎知識涉及不多，但是高屋建瓴地提供認識腫瘤免疫的路徑。腫瘤免疫基礎知識我們會通過PPT（免費）和視頻（收費）形式在公眾號分享。請果友們多多關注。

綜述論文 OPEN

腫瘤免疫治療歷史與進展：腫瘤浸潤免疫細胞的特征其治療意義

張媛媛和 張澤民

免疫治療使腫瘤治療發生革命性改變，并使腫瘤免疫煥發出新活力。多種免疫治療方法，如過繼細胞移植治療（ACT）和免疫檢查點抑制劑（ICIs）已經獲得持久的臨床反應，但其療效迥異，且只有部分腫瘤患者獲益。腫瘤微環境（TME）中的免疫浸潤在腫瘤發生、發展中發揮關鍵作用，并影響腫瘤患者的臨床預后。全面剖析腫瘤浸潤免疫細胞有助于闡明腫瘤-免疫逃逸的機制，從而為開發新的治療策略提供機遇。然而，腫瘤微環境的高度異質性和可變性阻礙了對腫瘤內免疫細胞的準確分離。隨著單細胞RNA測序（scRNA-seq）和質譜流式細胞技術等單細胞技術的最新進展，使得系統地分析腫瘤微環境成為可能，并為解析腫瘤浸潤免疫細胞的功能多樣性提供機會。本文綜述了腫瘤免疫治療的最新進展，重點介紹具有里程碑意義的研究和腫瘤相關免疫細胞的單細胞特性，并總結腫瘤內免疫細胞的表型多樣性及其與腫瘤免疫治療的關系。本文可以加深我們對腫瘤免疫治療進展的了解，有助于闡明免疫細胞在腫瘤進展中的調控作用，并為腫瘤治療開發新型免疫治療方法提供指導。

關鍵詞：免疫治療；腫瘤微環境；單細胞技術；腫瘤浸潤免疫細胞；表型多樣性

Cellular & Molecular Immunology (2020) 17:807–821; https://doi.org/10.1038/s41423-020-0488-6

引言

腫瘤是一種基因組疾病，其特點是基因組不穩定，在腫瘤發展過程中會出現大量點突變積累和結構改變 1,2 。基因組學變化引起腫瘤抗原產生，而這些抗原會被免疫系統識別為非自身來源，并觸發細胞免疫反應 3,4 。免疫系統之所以在免疫監視中發揮重要的作用 4,5，是因為適應性和先天性免疫系統的免疫細胞浸潤到腫瘤微環境（TME）以調控腫瘤進展 6,7 。固有免疫細胞由自然殺傷細胞（NK cell）、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和吞噬細胞（包括肥大細胞、中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞 （DC））組成，通過直接殺傷腫瘤細胞或觸發適應性免疫反應參與腫瘤抑制 8–10。適應性免疫系統的功能依賴于淋巴細胞（B細胞和T細胞），其中B細胞在體液免疫反應中起主要作用，而T細胞則參與細胞免疫反應 5,11,12。

有效的免疫應答既可以消滅腫瘤細胞，也可以損害腫瘤細胞的表型和功能 3。然而，腫瘤細胞已經進化出多種機制以逃脫免疫監視，如抗原提呈機制缺陷、上調負調控通路、招募抑制性免疫細胞亞群 13–17，從而導致免疫細胞效應功能受阻，抗腫瘤免疫應答喪失。

免疫治療旨在增強固有防御以消除腫瘤細胞，是腫瘤治療的重大突破，并已革新腫瘤學領域。雖然釋放宿主免疫系統來根除腫瘤的想法可追溯到一個世紀前 18,19，但直到近期才在基礎和臨床研究上取得重大進展。多種腫瘤對免疫治療有持久臨床反應 20–25，盡管應答率有限，且其潛在機制不明 26。免疫細胞是免疫治療的基礎；因此，了解腫瘤微環境中的免疫浸潤是腫瘤治療中提高反應率和開發新型免疫治療策略的關鍵。雖然腫瘤免疫的“生態系統”高度復雜并由多種細胞組成，但是單細胞技術已成為解析腫瘤微環境的有力工具 27。盡管已經投入大量精力研究T細胞特性，但是固有和適應性免疫系統的其他免疫細胞，包括樹突狀細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞和B細胞，也影響腫瘤進展和免疫治療的反應。在本文中，我們將概述腫瘤免疫治療的主要分類與發展歷史，腫瘤浸潤免疫細胞在人類腫瘤的最新研究結果及其與免疫治療的關系和潛在臨床應用。

圖1.免疫治療的主要種類。在臨床實踐中發展起來、具有廣闊前景的腫瘤免疫免疫治療形式包括：溶瘤病毒治療、腫瘤疫苗、細胞因子治療、過繼細胞移植免疫治療和免疫檢查點抑制。本文描述每種治療的基本原理及每步所涉及的細胞和分子基礎。（注：DCs，樹突狀細胞；NK，自然殺傷細胞；TCR，T細胞受體；CAT-T嵌合抗原受體T細胞）

免疫治療的主要種類

我們簡要回顧已用于腫瘤治療的免疫治療的既往研究。這些研究促進主要幾類免疫治療的發展。（圖1）

溶瘤病毒治療

一個多世紀以來，傳統免疫治療利用細菌或病毒感染來增強免疫應答。早在1863年，Virchow觀察到腫瘤組織總是伴隨著免疫系統的淋巴細胞浸潤，首次發現腫瘤和炎癥之間的聯系。最早的腫瘤免疫治療病例能追溯到1891年，免疫治療之父--William Coley，首次嘗試利用免疫系統治療腫瘤，觀察到活的和滅活化膿性鏈球菌和沙雷氏菌可能導致肉瘤患者的腫瘤消退。雖然這種前衛的治療策略為利用免疫系統治療腫瘤提供一種驗證性概念，但其作用機制及感染風險尚不明確。數十年后，溶瘤病毒治療被發現，該方法利用轉基因病毒感染腫瘤細胞，從而刺激產生促炎環境，增強全身性抗腫瘤免疫。隨著基因工程和病毒轉染技術的進步，溶瘤病毒治療近些年已經取得巨大進步。特別是talimogene laherparepvec（T-Vec，別名Imlygic），它是一種基因修飾的I型單純皰疹病毒，對晚期黑色素瘤患者的臨床療效很好，并已被批準用于治療不可切除的轉移性黑色素瘤。

腫瘤疫苗

腫瘤疫苗利用腫瘤特異性抗原激活T細胞介導的抗腫瘤免疫應答。之前報道的一項關鍵研究證實，MZ2-E和MZ2-D能被T細胞識別而激活免疫應答，MZ2-E和MZ2-D都是MAGE（黑色素瘤相關抗原）基因家族編碼的抗原。同時，在黑色素瘤患者體內腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）介導的免疫應答反應中，另一人類黑色素瘤抗原--gp100，被證明與腫瘤抑制相關。這些發現為腫瘤免疫治療中利用腫瘤抗原作為疫苗奠定理論基礎。除了腫瘤抗原，基于樹突狀細胞的疫苗也展示出顯著的臨床效果。樹突狀細胞是抗原提呈能力最強的抗原呈遞細胞（APC），在活化抗腫瘤免疫中發揮關鍵作用。具體來說，腫瘤抗原激活的樹突狀細胞能內化、加工處理抗原，并將加工的表位提呈給T細胞，從而誘導毒性T淋巴細胞（CTL）免疫應答。由于樹突狀細胞在抗原提呈中的主要作用，因而在基于樹突狀細胞的疫苗中得到應用，其中涉及用分離到負載有腫瘤抗原或腫瘤細胞裂解物的樹突狀細胞，這些樹突狀細胞經體外確定成熟的雞尾酒抗原刺激后再回輸至患者體內。其中典型的例子是sipuleucel-T，該疫苗是基于樹突狀細胞的免疫治療并已被批準用于晚期前列腺癌的治療。此外，完整腫瘤細胞也可以用來激活自發免疫應答。GVAX是一種自體腫瘤細胞經基因修飾后分泌粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子的腫瘤疫苗，已在多種腫瘤類型中顯示出增強腫瘤特異性免疫應答的潛力。這些進展強調腫瘤疫苗在腫瘤治療臨床應用中的重要性。

細胞因子

細胞因子是由免疫細胞和非免疫細胞分泌以應對細胞內應激狀態如感染、炎癥和腫瘤的發生，其功能是作為調節免疫系統細胞內相互作用以及溝通的信號。分泌型細胞因子能夠以復雜而高效的方式快速傳遞免疫信號，從而對靶抗原產生強有力的協同免疫應答。 細胞因子在腫瘤治療中的潛在應用獲益于1976年對白細胞介素2（IL-2）的認識。 IL-2最初被命名為T細胞生長因子，在體內、外都具有促進T細胞增殖的能力，從而發揮免疫刺激作用。 一個典型的細胞因子治療案例是，在轉移性腫瘤患者中大劑量應用IL-2可使腫瘤明顯消退。除IL-2外，在腫瘤治療中，干擾素-α（IFN-α）也是一種經典細胞因子治療。干擾素家族（IFNs）由大量細胞因子組成，其中屬于I型干擾素的IFN-α是多效能細胞因子，是決定抗腫瘤免疫效果的關鍵因子。IFN-α在腫瘤控制中發揮多種角色，包括通過誘導細胞衰老和凋亡直接消滅腫瘤細胞，通過刺激樹突狀細胞成熟和增強T細胞的細胞毒性而促進有效的抗腫瘤免疫應答。 臨床研究已經證實高劑量IFN-α對慢性髓系白血病和黑色素瘤的治療作用。盡管這些細胞因子具有臨床益處，但耐受性差和毒副作用嚴重，使得細胞因子作為單一治療的進一步應用受阻。不過，細胞因子與其他免疫治療如過繼細胞移植（ACT）聯合應用仍在研究中，以規避細胞因子治療的嚴重不良反應。

過繼細胞移植

過繼細胞移植（Adoptive cell transfer ACT）治療使用自體免疫細胞，特別是T細胞。這些細胞經過分離或基因工程改造，體外擴增，之后重新輸入患者體內以消滅癌細胞。過繼細胞移植治療已顯示出持續的臨床療效。Rosenberg等證明向轉移性腫瘤患者施用大劑量IL-2并聯合輸注自體淋巴因子激活殺傷細胞的治療是有效的。在首次成功過繼免疫治療試驗之后，研究小組隨后使用腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）改進這種方法，并證明IL-2擴增的腫瘤浸潤淋巴細胞過繼轉移顯示出更強的治療效果。這些研究為使用腫瘤浸潤淋巴細胞治療晚期人類腫瘤提供了理論依據。

此后發現，將針對過度表達、自身衍生分化抗原的高選擇性腫瘤反應性T細胞過繼移植輸注給轉移性黑色素瘤患者，可導致腫瘤患者T細胞持續性克隆再增殖。以上做法提示，在過繼轉移中可使用針對特定新抗原的基因修飾T細胞。當前，已經發明了兩種類型的基因修飾T細胞，即嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor, CAR）T細胞和T細胞受體（T-cell receptor, TCR）工程改造的T細胞用于過繼移植，并已經在惡性腫瘤治療方面取得實質性進展。

CAR-T細胞治療利用抗體片段來識別在癌細胞表面表達的特定抗原。第一代CAR-T細胞是通過表達免疫球蛋白-TCR嵌合分子作為功能性受體，具有抗體特異性的基因修飾T細胞。然而，這些CAR-T細胞直到1998年才能夠在體內持續存在。當時Maher等通過將CD28等共刺激分子引入到基因工程化CARs中，建立了新一代CAR-T細胞，使基因修飾T細胞能夠在體內持續存在并保持活性。隨后，他們證明CD19特異、CD28 / CD3-zeta雙重信號CAR修飾T細胞可以誘導成人急性淋巴細胞白血病的分子緩解。此外，還研究了其他分子與CAR偶聯時的功效。Porter等改造自體T細胞，使其表達與CD3-zeta和4–1BB信號域連接的抗CD19分子，用其靶向B細胞抗原CD19，發現這些被遺傳修飾的自體T細胞可在慢性淋巴細胞白血病（CLL）患者中產生強有力的CD19特異性免疫應答。這些發現揭示了CAR-T治療在人類腫瘤治療中的良好前景。Clay等首先報道用TCR工程改造的T細胞或TCR-T治療方法。他們證明將TCR基因轉移到黑色素瘤患者的外周血淋巴細胞（PBL）中可以產生具有抗腫瘤反應性的效應T細胞。隨后，當用TCR工程化T細胞治療轉移性黑色素瘤患者時，這種治療的臨床潛力得到證實。

值得注意的是，在腫瘤細胞中異常表達的典型腫瘤-睪丸抗原NY-ESO-1，已被轉基因TCR-T細胞靶向，介導持續的抗原特異性抗腫瘤作用，最終導致腫瘤退縮。因此，CAR-T細胞治療和TCR-T細胞治療都在腫瘤治療方面取得實質性進展，并已取得令人鼓舞的臨床效果。

免疫檢查點抑制劑

盡管過繼細胞移植治療取得巨大進展，但一類新型的單克隆抗體（monoclonal antibodies, mAbs）即免疫檢查點抑制劑（ICIs），現已進入醫學實踐，并成為最重要的免疫治療方法之一。免疫檢查點分子即共抑制信號傳導途徑的分子，其作用是維持免疫耐受，但經常被癌細胞利用以逃避免疫監視。免疫檢查點抑制劑旨在通過阻斷共抑制信號通路來恢復抗腫瘤免疫反應，并促進免疫介導的惡性細胞清除。其最廣泛使用的靶點是細胞毒性T淋巴細胞相關分子4（CTLA-4）、程序性細胞死亡受體1（PD-1）和程序性細胞死亡配體-1（PD-L1）。

CTLA-4是一種在T細胞上表達的共抑制分子，具有負調節T細胞活化的功能。一項開創性研究表明，用抗體阻斷CTLA-4可以誘導有效的免疫反應并導致腫瘤消退，開啟了用抗體給免疫細胞”松開剎車”來增強抗腫瘤免疫反應的時代。經臨床試驗和療效評估后，CTLA-4單抗ipilimumab以其增強T細胞活化和持續誘導免疫反應的能力，成為首個被批準用于腫瘤治療的免疫檢查點抑制劑。同時，PD-1被發現在T細胞表面表達，最初被認為參與程序性細胞死亡，后來證明PD-1是免疫反應的負調節分子。然而，PD-1的調節機制在其配體PD-L1的發現之前仍然是難以捉摸的。PD-L1在正常組織中表達，當與PD-1結合時，通過抑制TCR介導的淋巴細胞增殖和細胞因子分泌來調節免疫耐受。然而，腫瘤細胞也異常表達PD-L1以逃避免疫監視。研究表明，抑制PD-1或PD-L1可以恢復T細胞的細胞毒性能力并誘導腫瘤消退，提示PD-1或PD-L1可以作為治療靶點。事實上，阻斷PD-1通路已取得顯著的臨床效果，靶向PD-1或PD-L1的抗體已被批準用于治療多種腫瘤 。

該綜述下篇主要是腫瘤微環境中免疫細胞浸潤的總結，是我們關注的核心。

腫瘤浸潤免疫細胞及其與免疫治療的關系

腫瘤免疫治療，如細胞過繼轉移和腫瘤免疫檢查點抑制劑治療的成功，已經證明免疫細胞，特別是T細胞，可以用來消除腫瘤細胞。盡管免疫治療有持續的臨床療效，但只有一小部分腫瘤患者從中受益。作為腫瘤微環境的主要組成部分，免疫浸潤已被證實有助于腫瘤進展和免疫治療反應。因此，更好地理解腫瘤微環境中的固有免疫細胞和適應性免疫細胞對于破譯免疫治療機制、定義預測性生物標志物和識別新的治療靶點至關重要。

注：無論是基礎研究還是生信分析，免疫浸潤細胞一般包括6種細胞，T細胞、B細胞、NK細胞（俗稱TBNK），樹突狀細胞、巨噬細胞和中性粒細胞（統稱髓系細胞）。

T細胞

因具有強效的腫瘤殺傷能力，T細胞成為腫瘤免疫的焦點。T細胞通過主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex, MHC）分子或人類白細胞抗原呈遞的腫瘤抗原短肽與T細胞受體（TCR）反應而發揮作用。T細胞受體由大量TCR基因片段隨機重組的基因重排產生，其過程可能產生各種T細胞受體組成成分，賦予T細胞多樣性和特異性。腫瘤浸潤淋巴細胞在有效抗腫瘤免疫中起關鍵作用，并且不同類型T細胞，包括細胞毒性T細胞（CTL），輔助性T細胞（T）和調節性T細胞（Tregs），均參與腫瘤微環境內T細胞介導的免疫反應。

細胞毒性T細胞是關鍵的效應細胞，可與細胞毒性分子，如顆粒酶和穿孔素，一起發揮功能。研究表明，腫瘤浸潤淋巴細胞，特別是細胞毒性T細胞的存在，與多種癌癥患者存活呈正相關。但是，由于腫瘤微環境的免疫抑制導致其耗竭或功能失調，腫瘤部位浸潤的細胞毒性T細胞往往不能控制腫瘤生長。T細胞耗竭的特征是PD-1和其它抑制分子上調，最初在慢性淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒感染的小鼠模型中報道，并證明在人類癌癥中普遍存在。例如，Thommen等對非小細胞肺癌（NSCLC）患者中PD-1表達水平不同的三群瘤內CD8腫瘤浸潤淋巴細胞亞群的特性進行分析，發現PD-1高表達的腫瘤浸潤淋巴細胞已耗竭，但可預測非小細胞肺癌患者對PD-1抗體治療的反應。這些發現及免疫檢查點抑制劑深入人心的臨床療效突顯了干預T細胞功能異常在腫瘤治療中的重要性。

CD4 T細胞包含輔助性細胞和調節性T細胞。輔助性T細胞通過幫助CD8效應T細胞或通過充當細胞毒性T細胞來直接消除腫瘤細胞而有助于抗腫瘤免疫。與此相反，調節性T細胞對于維持穩態必不可少，通過可溶性免疫抑制因子直接破壞T細胞功能，以及CTLA-4介導的抑制抗原呈遞細胞共刺激信號間接阻止T細胞活化，從而協調抗腫瘤免疫。值得注意的是，抗CTLA-4抗體不僅可以阻斷負調節信號通路來加強T細胞反應，也可誘導Treg耗盡，表明免疫檢查點抑制劑在抗腫瘤免疫中作用機制復雜。

B細胞

B細胞是在適應性免疫系統體液免疫中起作用的體液免疫細胞。在被感染細胞或腫瘤細胞的刺激下，B細胞分化為記憶B細胞或漿細胞，后者可分泌免疫球蛋白（Igs，也稱為抗體）以結合并中和靶抗原。值得注意的是，B細胞激活涉及抗原與B細胞受體（BCR）相互作用。BCR是膜結合形式的Ig（mIg），賦予B細胞抗原特異性。每個B細胞都具有獨特的BCR，該BCR源自Ig基因片段隨機重排產生的高度多樣化的BCR基因庫。BCR基因庫具有不同的抗原特異性，當遇到抗原時，可以通過生發中心的類型轉換重組和體細胞超突變進一步修飾所選擇的BCR，從而獲得針對靶抗原的最佳抗體。

B細胞不僅通過產生的抗體在體液免疫中起著至關重要的作用，而且還通過充當抗原呈遞細胞來增強T細胞介導的免疫反應，或通過細胞因子或調節性B細胞調節免疫應答，參與細胞免疫。此外，B細胞在慢性炎癥和腫瘤部位輔助維持二級淋巴器官結構和促進三級淋巴結構（TLSs）形成。三級淋巴結構是免疫細胞，如T細胞、B細胞和濾泡樹突狀細胞聚集的高級有序結構。三級淋巴結構對于B細胞和T細胞募集和局部激活特別重要，因此有助于長期免疫。

由于在體液和細胞免疫中的多功能性， B細胞在抗腫瘤免疫中表現出表型多樣性。研究表明，腫瘤浸潤B細胞（Tumor-infiltrating B cells，TIB）通過分泌可溶性因子促進髓樣細胞促血管生成和促腫瘤功能，或通過產生促進腫瘤細胞信號轉導的因子來抑制T細胞介導的免疫反應，從而促進腫瘤進展。然而，與促腫瘤作用相反的是，越來越多研究表明B細胞具有抗腫瘤免疫功能，并可能有利于患者預后。研究證明，CD20 腫瘤浸潤B細胞與非小細胞肺癌和卵巢癌患者的預后良好相關，機制可能是充當抗原呈遞細胞來增強細胞毒性T細胞反應。值得注意的是，Cabrita等發現，三級淋巴結構形成以及腫瘤中CD20 B細胞和CD8 T細胞同時存在與轉移性黑色素瘤患者的生存期改善有關，并可預測免疫檢查點抑制劑的臨床效果。與這些觀察一致的是，B細胞與免疫治療反應有關。Hollern等在高突變負荷的三陰性乳腺癌小鼠模型中發現，免疫檢查點抑制劑可誘導濾泡輔助性T細胞和B細胞的活化，而活化的B細胞通過分泌抗體和呈遞抗原激活T細胞來促進抗腫瘤反應。與小鼠研究的這些發現相一致，臨床研究也強調B細胞與三級淋巴結構在腫瘤免疫治療中的重要性。例如，Jahrsd?rfer等發現B細胞可產生顆粒酶B，并可在B-CLL中基于IL-2活化而獲得細胞毒性。此外，Petitprez等發現，包含B細胞和其他免疫細胞的三級淋巴結構為特征的軟組織肉瘤亞型患者，其生存率改善，PD-1阻斷劑反應率較高。同時，Helmink等發現，在對免疫檢查點抑制劑治療有反應的轉移性黑色素瘤和轉移性腎細胞癌（RCC）患者腫瘤的三級淋巴結構中，CD20 B細胞與T細胞存在共定位。此外，他們進一步鑒定到有反應患者中存在明顯的克隆擴增和BCR多樣性，為深入了解B細胞和三級淋巴結構在腫瘤免疫治療的關鍵作用提供視角。

因此，盡管還需要進一步研究以闡明B細胞介導反應在免疫治療中的機制，這些發現已指出B細胞在抗腫瘤免疫調節中的關鍵作用，并表明B細胞和三級淋巴結構在腫瘤治療的重要應用。

NK細胞 （自然殺傷細胞）

NK細胞是能發揮細胞毒作用而無MHC特異性的典型固有淋巴樣細胞，因此能與細胞毒性T細胞所介導的MHC限制性腫瘤溶解相輔相成。NK細胞可通過溶細胞顆粒直接清除腫瘤細胞，還可通過促炎細胞因子和趨化因子協同其他免疫細胞起作用。重要的是，NK細胞的活化是由其表面的激活或抑制性受體共同介導的。抑制性受體能與正常細胞上的MHC I類分子相互作用，使NK細胞產生自身耐受。而激活性受體則感知細胞應激（病毒感染或病毒感染細胞發生腫瘤增生，及或腫瘤細胞MHC I類分子表達缺失）的信號，從而引起NK細胞的活化和效應作用。越來越多研究表明，在腫瘤微環境中，NK細胞的功能會因細胞毒效應減弱和促炎性因子的表達改變而受到阻礙。B?ttcher等發現腫瘤中的NK細胞能在腫瘤微環境中募集cDC1 細胞，并促進抗腫瘤免疫，而腫瘤細胞能產生前列腺素E2損害NK細胞的功能，引起免疫逃逸。因此，NK細胞也可作為潛在的靶點。

現已探索出幾個基于NK細胞的免疫治療, 包括過繼轉移自體抑制NK細胞，也就是把從活體中提取的活化NK 細胞和，經體外擴增后輸注到患者體內。還有CAR-NK細胞治療，也就是輸注改造過的NK細胞，這類NK細胞能表達抗特定腫瘤抗原CARs。還有細胞因子治療，也就是輸注增強NK細胞活性的特定細胞因子。最后，還有基于mAbs的治療，指輸注抗體以阻斷NK細胞上的抑制性受體。

跟阻斷T細胞上抑制性通路的免疫檢查點抑制劑相似，阻斷NK細胞上的抑制性受體同樣頗有前景。幾種NK細胞抑制性受體的治療潛力和臨床應用已經在探索階段。殺傷免疫球蛋白受體家族（KIR）和CD94/NKG2A異質二聚體是人類NK細胞上主要的抑制性受體。單獨應用抗KIR抗體或聯合其他治療藥物能提高NK細胞的抗腫瘤效應。另外，抗NKG2A抗體在觸發NK細胞反應方面同樣有效。還有Monalizumab，一種新型抗NKG2A抗體，目前正處在檢驗抗腫瘤效能的臨床試驗階段。需要著重說明的是，除了抑制受體，激活受體也能被利用, 如用細胞因子上調它們的表達，或傳遞覆蓋目標細胞的抗體來激發NK細胞毒性。舉個應用該方法頗有成效的例子，Andrade 等設計了可避免人腫瘤細胞丟失細胞表面MICA和MICB的抗體，MICA和MICB都是應激誘導分子，能被NK細胞上NKG2D的激活受體識別。他們還發現，這些抗體通過增強NK細胞介導的抗腫瘤免疫抑制腫瘤生長。綜合考慮，將NK細胞應用于治療中有很好的前景，值得進一步探索。

骨髓細胞

髓系細胞包含異質的細胞亞群，有粒細胞和單核巨噬細胞，它們也被證明在腫瘤免疫中扮演關鍵的作用。

粒細胞中最常見的亞型是中性粒細胞，其典型功能是在固有免疫中抵抗細菌和真菌感染，但其在腫瘤免疫中的角色尚具爭議。Szczerba等發現，中性粒細胞輔助血流中循環腫瘤細胞，有促進其轉移的潛能。而Ponzetta等則發現中性粒細胞在一種固有樣表型非常規T細胞的極化中起關鍵作用，因此有助于抗腫瘤免疫。另外，Fridlender等發現中性粒細胞在腫瘤微環境中有不同的激活狀態，N1表型起抗腫瘤生成作用，而N2起促腫瘤生成作用。這些發現強調腫瘤相關中性粒細胞作用的多樣性，因此有必要做更深入的研究，全面剖析人類腫瘤中的腫瘤相關中性粒細胞，而這有可能開啟通過調節中性粒細胞作為腫瘤治療的新模式。

單核吞噬細胞，由單核細胞，巨噬細胞，樹突狀細胞組成，通過感知病原體和吞噬作用在固有免疫中起作用，并作為相互作用的細胞成分在適應性免疫中將抗原提呈給T細胞。樹突狀細胞是主要的抗原呈遞細胞，現已確認樹突狀細胞主要有兩種亞型，即類漿細胞樹突狀細胞（pDCs）和傳統樹突狀細胞（cDCs）。pDCs能產生高水平 I型干擾素并在調節固有和適應性免疫中起重要作用。雖然pDCs最初被認為在抗病毒免疫中起作用，但近期研究者對其在腫瘤發生方面起的作用產生了興趣。研究表明，pDCs的次級產物，尤其是I型干擾素，在腫瘤免疫中同時有免疫原性和致耐受性作用。這些因子通過提高NK細胞和T細胞的細胞毒性，輔助激活B細胞向漿細胞分化，促進樹突狀細胞和促炎癥反應性巨噬細胞的成熟和活化，最終共同促成一個免疫活化的腫瘤微環境。它們同時通過募集Treg細胞或誘導免疫調節分子（如參與負調控途徑的免疫調節分子）的表達，營造免疫抑制腫瘤微環境。另外，pDCs能作為專業的抗原呈遞細胞調節抗腫瘤免疫反應。因此，pDCs在腫瘤免疫中的多樣化角色尚未明晰。cDCs包含兩種亞型：cDC1s和cDC2s，它們有著不同的表型，功能和轉錄因子依賴。cDC1s專門將MHC I上的抗原提呈給CD8 T細胞。而cDC2s將MHC II上的抗原提呈給CD4 T細胞。cDC1s通過腫瘤微環境里的局部效應和向腫瘤引流淋巴結(dLNs)的抗原呈遞促成抗腫瘤免疫。具體來說，腫瘤微環境中的cDC1s分泌如CXCL9和CXCL10的趨化因子以協助效應T細胞和NK細胞向腫瘤聚集，還產生細胞因子幫助維持效應細胞的細胞毒性作用。另外，cDC1s能遷移到引流淋巴結，將腫瘤抗原多肽提呈給初始型CD8 T細胞，引起抗原特異性免疫反應的活化和啟動。cDC2s是最常見且異質性最高的DC亞型，它們促進大量CD4 T細胞介導的免疫反應。雖然cDC2s被認為主要通過激活T細胞來起作用，但其在抗腫瘤免疫中的具體作用尚未明確。研究者對解析cDC2s在腫瘤微環境中的異質性和功能的興趣與日俱增。

巨噬細胞是一類吞噬細胞，包括一群在腫瘤微環境中有復雜表型和特性作用的異質性細胞群。巨噬細胞能通過吞噬作用或通過產生可溶性因子誘導腫瘤細胞凋亡從而清除惡性細胞。除了直接的腫瘤殺傷能力，巨噬細胞還通過血管新生，纖維化和免疫監測等機制，在調節腫瘤進展中起重要作用，巨噬細胞可通過分泌不同分子動員或中和血管內皮生長因子來發揮促血管生成和抗血管生成作用，從而調節腫瘤微環境中的血管生成。同時，巨噬細胞是腫瘤相關纖維化的關鍵協調者，它通過不同的介質來促進或抑制細胞外基質堆積，從而改變鄰近的成纖維細胞，誘導形成的纖維化能調節T細胞的滲透和活化。此外，巨噬細胞能產生干擾素IL-12和表達包括CD86在內的共刺激分子，引起細胞相互作用，從而介導T細胞活化。相反，巨噬細胞也能通過表達T細胞抑制分子，分泌免疫抑制性因子或促進免疫抑制性Tregs募集這三種方式介導T細胞的抑制。因此，腫瘤相關巨噬細胞（TAM）在腫瘤微環境中有顯著的作用，并可能帶來腫瘤免疫治療的新機遇。

單細胞水平研究腫瘤免疫浸潤細胞的新技術

作為適應性免疫的關鍵組成部分，T細胞由于其對抗原識別的特異性和強大的腫瘤殺傷力而成為免疫治療的核心。腫瘤浸潤淋巴細胞是由具有復雜功能狀態（如幼稚，效應因子，記憶和功能障礙）的不同亞群組成的異質細胞群（如CD8 +，CD4 + TH1，TH2，TH17和Treg細胞）。另外，這些T細胞亞群表現出對組織分布的偏好和表腫瘤微環境中的跨組織遷移和狀態轉變的動態特性。

由于這種異質性，常規方法無法解析各種T細胞亞群的特征。隨著單細胞技術的發展，單細胞分析下大量腫瘤浸潤免疫細胞的特點引起腫瘤免疫學家的極大興趣。最近，新型單細胞方法，包括質譜流式細胞術和單細胞測序（scRNA-seq），已呈現出發展勢頭，并促進對腫瘤相關T細胞和其他免疫細胞特點的了解（圖2和 圖3）。

單細胞蛋白質分析是了解腫瘤浸潤淋巴細胞表型異質性的重要方法。質譜流式細胞術（CyTOF）利用金屬同位素標記的抗體與微調質譜檢測相結合，能夠以低成本量化數百萬個細胞中的40多種蛋白質。相比之下，單細胞測序包括plate-based 和droplet-based兩種技術方法(圖2a)，可以同時量化成千上萬個轉錄本。因此，它能夠揭示稀有細胞群，揭示復雜的調控機制，并跟蹤發育過程。近來，這兩種方法已用于評估各種類型腫瘤的腫瘤生態系統(圖2), 因為蛋白組和轉錄組都可以提供對腫瘤微環境中免疫浸潤功能特征的重要認識。

通過單細胞技術捕獲T細胞狀態

單細胞研究描繪不同類型腫瘤組織如皮膚，肺，腎，乳腺，結腸和頭顱的T細胞特征，包括組成、功能狀態以及病灶的動態變化 (圖2b)。這些研究使我們對腫瘤免疫浸潤有了一定了解，為探究免疫逃逸的機制和開發進一步增強抗腫瘤免疫力的新策略提供機遇。

高腫瘤突變負荷（TMB）黑色素瘤，由于其對免疫檢查點抑制劑治療具有高反應率，因此處于腫瘤免疫學研究的前沿。Tirosh等應用scRNA-seq方法研究轉移性黑色素瘤的多細胞生態系統，并分析惡性細胞和非惡性細胞的表型多樣性。盡管受細胞數量的限制，但該研究通過T細胞分析再現腫瘤浸潤淋巴細胞的衰竭表型。同樣，Li等發現功能失調的腫瘤浸潤淋巴細胞是高度增殖，動態分化的單克隆細胞群，在黑素瘤的腫瘤微環境中表現出連續的分化圖譜。這樣的研究為我們提供了解TME腫瘤微環境中T細胞特征的機會，并擴展我們對人類黑素瘤T細胞功能衰竭的認識。

肺癌具有廣泛的基因組改變，并且對檢查點阻斷治療有更好的應答。因此，肺癌通常是腫瘤免疫治療的研究目標。Lambrechts等提出肺癌中腫瘤生態系統的單細胞轉錄組學目錄。然而，盡管有大量免疫細胞，但他們強調基質細胞的表型構建及其對免疫細胞的調節，從而與免疫治療建立間接聯系。相反，Lavin等利用質譜流式細胞術繪制與早期肺癌相關的免疫細胞圖譜。 他們通過在腫瘤病灶處觀察到CD8效應T細胞顯著減少，伴隨著Tregs細胞擴增和T細胞耗竭，發現免疫抑制性微環境。類似地，GUO等應用scRNA-seq技術描繪非小細胞肺癌中T細胞的轉錄組學情況。他們描繪腫瘤浸潤淋巴細胞的變化軌跡，并確定兩簇將耗竭CD8 T細胞的功能狀態，這兩種細胞均與良好預后相關。這些發現為肺癌T細胞的功能狀態和動力學提供更深入的見解，這將有助于腫瘤治療和患者分層。

腎細胞癌（RCC）是成人中最常見的腎臟腫瘤，盡管與黑色素瘤或非小細胞肺癌相比其腫瘤突變負荷較低，但是其插入和缺失突變率卻很高。腎細胞癌患者的亞型可受益于免疫檢查點抑制劑治療，而納武單抗（nivolumab）是一種已被批準用于治療轉移性腎細胞癌的抗PD-1抗體。Young等構建健康人和腫瘤患者腎臟的單細胞轉錄組數據，并鑒定腎腫瘤細胞及其組成。盡管他們同時鑒定免疫細胞和非免疫細胞，并重點關注非免疫細胞部分，但其提供的腎細胞癌中免疫細胞功能的信息仍然有限。相比之下，Chevrier等提出基于質譜流式細胞術的透明細胞腎細胞癌（ccRCC）（最常見的腎細胞癌類型）中免疫浸潤的單細胞圖譜，并揭示腫瘤微環境中免疫細胞的表型復雜性。透明細胞腎細胞癌中T細胞的免疫抑制表型，包括功能耗竭T細胞和抑制性Tregs細胞。這些發現擴展了我們對T細胞表型多樣性的看法，并為腎細胞癌的免疫治療提供候選靶點。

結直腸癌（CRC）對免疫腫瘤學家的吸引力很大，因為其腫瘤浸潤免疫細胞比組織病理學方法更能預測結直腸癌患者的存活率。此外，免疫檢查點抑制劑對患有微衛星不穩定性（MSI）的結直腸癌患者有效，但對微衛星穩定的患者無效，其分子機制尚不明確。Li等學者使用scRNA-seq技術進行結直腸癌腫瘤生態系統的轉錄組分析。由于該研究專注于聚類算法開發，因此該研究提供的生物學見解有限，尤其是對于結直腸癌中的免疫細胞功能。值得注意的是Zhang等通過RNA測序和TCR追蹤（STARTRAC）法整合單T細胞分析，對結直腸癌中的T細胞進行綜合分析。

他們闡述具有不同功能和不同克隆的T細胞亞群動態關系。此外，他們發現Th1樣亞型主要表達微衛星不穩定性患者中，這闡釋其對免疫檢查點抑制劑反應良好的潛在細胞機制。這些發現加深我們對CRC中T細胞特征的了解，并加速了免疫檢查點抑制劑治療機制的研究。

由于免疫學上的“冷結節”表型，乳腺癌（BC）歷來被認為難以進行免疫治療，但最近研究表明，免疫檢查點抑制劑具有改善乳腺癌患者亞型結局的潛力。單細胞研究提供對腫瘤生態系統的了解，包括乳腺癌中的免疫細胞多樣性。Chung等在原發性乳腺癌中進行單細胞轉錄組分析。盡管受細胞數量的限制，但這項研究發現，在乳腺癌腫瘤微環境中腫瘤內存在異質性并觀察到T細胞顯示出的免疫抑制特性。同樣，Savas等揭示乳腺癌中T細胞亞群的細胞異質性，并發現有助于乳腺癌免疫監視的組織駐留記憶T細胞亞群表達高水平免疫檢查點分子和效應蛋白。盡管此類分析為乳腺癌腫瘤學中的T細胞功能提供重要線索，但是在乳腺癌中腫瘤浸潤淋巴細胞的表型可塑性和動態變化仍需進一步探索。重要的是，Azizi等提供人類乳腺癌中免疫細胞的大規模單細胞轉錄圖。他們發現，T細胞簇具有多種不同的環境特征，腫瘤駐留T細胞被定位在連續的活化和分化軌跡上，組合的環境刺激和TCR利用塑造腫瘤浸潤淋巴細胞的多種表型。這項研究為乳腺癌中腫瘤浸潤免疫細胞的表型多樣性提供更為細致入微的觀點，這可能有助于更好地了解腫瘤進展和治療反應的機制。盡管涉及不同的乳腺癌亞型，但該研究受患者人數的限制，無法提供足夠的信息來評估乳腺癌各類亞型中免疫細胞表型的區別。相反，Wagner等破譯具有乳腺癌亞型的患者的腫瘤和免疫細胞的單細胞蛋白質組學，從而了解不同乳腺癌亞型之間的生態系統差異，尤其是免疫細胞的差異。值得注意的是，他們在高級別雌激素受體陰性（ER-）和ER陽性（ER+）腫瘤中觀察到較高水平的Tregs細胞和耗竭T細胞，可能表明ER-和ER+患者有對免疫檢查點抑制劑更好反應的細胞基礎。在乳腺癌生態系統中的此類腫瘤免疫關系，可以幫助指導患者分層并促進個性化免疫治療。其他具有腫瘤微環境單細胞特點的腫瘤包括頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）和肝細胞癌（HCC）。Puram等通過scRNA-seq技術研究了頭頸部鱗狀細胞癌中的原發性和轉移性腫瘤生態系統。他們鑒定頭頸部鱗狀細胞癌中不同的T細胞亞群，并確定T細胞功能衰竭程序，然而，由于關注點主要集中于非免疫部分，他們提供的關于T細胞功能的信息則是有限的。Zheng等繪制肝癌單細胞T細胞的轉錄圖譜，并通過觀察腫瘤中浸潤的Tregs細胞和CD8 T細胞的克隆富集，發現腫瘤內T細胞的免疫抑制表型。這項研究首次對腫瘤浸潤淋巴細胞進行大規模和深入分析，揭示HCC進展的潛在細胞機制。

綜合來說，這些基線數據分析共同闡明多種腫瘤中腫瘤浸潤淋巴細胞的基本特性。不同腫瘤中的腫瘤浸潤淋巴細胞在抗腫瘤免疫方面表現出共同和特定的特點，這可能是由不同器官的特殊組織微環境驅動的。因此，對更多腫瘤患者進行T細胞特征的全面分析將闡明腫瘤進展的機制和治療應答的差異，從而促進腫瘤治療中的個性化免疫治療。

盡管細胞組成和功能狀態是腫瘤浸潤淋巴細胞的主要特點，但其抗原特異性也可作為抗腫瘤免疫應答的關鍵決定因素，并可影響免疫治療的有效性。越來越多證據表明，腫瘤中相當一部分T細胞與癌旁正常組織有共同的TCR（T細胞受體），這表明它們可能與抗腫瘤免疫無關。此類T細胞代表靶向突變背景或病毒感染的“旁觀者”T細胞，或者它們可能反映由腫瘤內炎癥反應驅動的效應或記憶T細胞從血液向組織的連續遷移。重要的是，臨床上有效的腫瘤浸潤淋巴細胞是靶向腫瘤抗原T細胞；因此，分離腫瘤反應性T細胞對基于T細胞的免疫治療至關重要。實際上，目前已經建立用于確定、分離和擴增T細胞特異性抗原的創新策略。Simoni等證明特異性標記物如CD39可用于鑒定腫瘤反應性T細胞。 Tran等將腫瘤浸潤淋巴細胞與自體樹突狀細胞共培養，并體外轉染編碼自體腫瘤突變基因短肽的串聯基因mRNA，以分離與腫瘤特異性抗原反應的T細胞。此外，Dijkstra等利用自體腫瘤類器官與PBLs（外周血B淋巴細胞)的共培養來從外周血中富集腫瘤反應性T細胞。這種方法為臨床應用提供分離腫瘤反應性T細胞的有效手段。

雖然上述未經治療腫瘤的基線概況分析提供了腫瘤浸潤淋巴細胞在多種腫瘤中的固有特性，但關于治療或干預研究可更好地了解免疫治療分子基礎和開發預測臨床療效的新方法。Jerby-Arnon等應用scRNA-seq技術研究免疫檢查點抑制劑治療前后人黑素瘤中的腫瘤細胞狀態。他們發現惡性腫瘤細胞可以表達與T細胞排斥和免疫逃逸相關的耐藥性程序，結合免疫治療可抑制腫瘤的生長。這些發現提出攻克免疫檢查點抑制劑耐藥的新策略。然而，與腫瘤細胞的分子變化相比，人們更多關注免疫檢查點抑制劑治療中腫瘤浸潤淋巴細胞的表型和功能動力學。通過對接受免疫檢查點抑制劑治療的黑色素瘤患者單個免疫細胞進行分析，Sade-Feldman等發現CD8 T細胞表達TCF7蛋白或功能失調的兩種獨特狀態可以預測免疫檢查點治療的成功或失敗，從而突顯腫瘤微環境中異種T細胞亞型的臨床意義。同樣，Yost等對抗PD-1抑制劑治療的基底或鱗狀細胞癌患者T細胞進行成對單細胞RNA和TCR測序，并揭示PD-1阻斷后腫瘤特異性T細胞的克隆替代。具體來說，他們發現免疫檢查點抑制劑處理可誘導T細胞的克隆擴增，而克隆擴增并非源自先前存在的腫瘤浸潤淋巴細胞，而是由新型克隆型組成。這些結果強調全身免疫反應的重要性以及募集外周T細胞對免疫檢查點抑制劑治療有效的必要性。

外周血中T細胞可以遷移并浸潤到腫瘤中，以補充效應池。因此，在免疫檢查點抑制劑治療前和后人外周血單個核細胞的變化也得到深入研究。Wu等對不同腫瘤患者T細胞RNA和TCR進行單細胞測序，他們發現在腫瘤組織、鄰近正常組織和外周血整個系統水平上，類效應器T細胞的克隆性擴增可以介導更好地抗PD-L1治療反應。這些發現表明，對免疫檢查點抑制劑有效應答需要外周血中補充新鮮的、未耗竭的T細胞。同樣，Krieg等使用質譜流式細胞術鑒定轉移性黑色素瘤患者抗PD-1免疫治療之前和之后外周血中的免疫細胞亞群。他們發現，在應答者中，當腫瘤中CD8 T細胞增加時外周血中的T細胞則是減少的，這表明免疫檢查點抑制劑應答和系統免疫具有重要性的主要原因是CD8 T細胞具有更高的遷移能力。值得注意的是，他們發現髓樣細胞的突變頻率還可以預測抗PD-1治療反應性，從而強調髓樣細胞在抗腫瘤免疫應答及其潛在臨床應用中的重要性。

盡管T細胞已是腫瘤免疫治療的重要靶點，人們希望采用單細胞技術探索髓樣細胞的異質性。近年來，髓樣細胞也受到關注，因為髓樣細胞在腫瘤微環境中表現出特定的表型和功能，這些表型、功能通過調節T細胞功能、直接調節腫瘤細胞的生長，進而影響腫瘤進展和免疫治療的反應 （圖3）。

作為專職抗原呈遞細胞，樹突狀細胞不僅在T細胞活化中起著核心作用，并且是維持長期抗腫瘤適應性免疫反應的必要條件。從不同樹突狀細胞亞群的表型和功能來看，雖然pDCs和cDC1在抗腫瘤免疫中的作用可能還需要進一步驗證，但是由于二者構成相對同質，目前它們的功能較為清楚。相比之下，cDC2s由異質組分構成，因此其功能尚不清楚。單細胞技術使人們不論在健康和疾病狀態下都可以全面探知樹突狀細胞組分。例如，Villani等使用scRNA-seq在人血液的cDC2s亞群中確定一個新的分支表型。同樣，Ductertre等在風濕性疾病活動性相關的循環炎性樹突狀細胞和生物標記物的基礎上, 從功能上揭示cDC2s中獨特的亞群。關于腫瘤中樹突狀細胞亞群，Brown等發現以不同發育途徑和轉錄調控因子為特征的兩種主要cDC2s譜系，二者在小鼠和人類黑色素瘤中表現出明顯的促炎和抗炎潛能。Zhang等報道稱，表達LAMP3的cDCs子細胞亞群可從肝腫瘤轉移到肝淋巴結并調節淋巴細胞的活化。這些發現強調樹突狀細胞亞群的異質性，并促進樹突狀細胞特定亞群相關靶向免疫治療的發展。

圖2.不同類型腫瘤單細胞分析策略和單細胞研究。a.單細胞技術工作流程，包括單細胞測序和流式細胞術。對于單細胞測序，深度分析或大規模分析基于平板和液滴的常用策略。b.基于目前單細胞技術分離各種組織類型腫瘤免疫浸潤的研究總結。（注：Tech技術；FACS熒光激活細胞分選；T腫瘤；N鄰近正常或健康組織；P外周血；其他細胞、非免疫細胞（包括惡性細胞和間質細胞）；scTCR單細胞TCR信息；BCC基底細胞癌；SCC鱗狀細胞癌；NSCLC非小細胞肺癌；RCC腎癌；ccRCC腎透明細胞癌；CRC大腸癌；BC乳腺癌；HCC肝細胞；HNSCC頭頸部鱗狀細胞癌；Endo AD子宮內膜腺癌。）