讓細菌“吃”甲醇“吐”高價值氨基酸

在甲醇無機鹽培養基中，經過基因改造的菌株將廉價的甲醇轉化為L-精氨酸，一套全新的合成生物學工具包首次讓這一高效轉化成為可能。近日，中國科學院天津工業生物技術研究所（以下簡稱“天津工生所”）成功開發出一套針對甲醇芽孢桿菌的合成生物學使能技術，突破了這一一碳生物制造潛力底盤的技術瓶頸，現該成果已發表于國際期刊《Cell Reports》。

據悉，該技術包括高效的DNA電轉化方法、基于熱穩定CRISPR-Cas9系統的基因組編輯技術、用于基因穩定表達的染色體中性位點以及用戶友好的生物設計工具。這套工具包包含了多個關鍵技術創新，從基礎轉化效率提升到復雜的基因編輯和代謝調控，形成了一套完整的技術體系。研究團隊利用該工具包成功構建了無質粒、表型穩定的工程底盤，并改造底盤首次實現了以甲醇為唯一碳源生產L-精氨酸。

研究中，天津工生所的團隊系統優化了DNA電轉化方法，將轉化效率較原方法提升了1000倍，為后續遺傳操作奠定了基礎。同時，通過比較不同熱穩定CRISPR-Cas9系統，研究團隊選擇ThermoCas9進行基因編輯測試，結果顯示該系統具有超過98%的靶向致死率。使用1kb同源臂即可實現高效的基因組敲除，敲除4kb以內片段的效率接近100%，并可實現40kb大片段的敲除以及雙基因的同時敲除。

隨后，利用這套先進的基因編輯系統，研究團隊對甲醇芽孢桿菌內源質粒pBM19和pBM69以及染色體上的甲醇代謝基因拷貝進行了精準敲除。研究結果顯示，pBM19質粒攜帶6個甲醇代謝基因，質粒敲除菌完全喪失了在甲醇無機鹽培養基中生長的能力。而攜帶限制性內切酶BmeTI的pBM69質粒的敲除菌，可以顯著提高無m6A甲基化質粒的轉化效率。

研究還發現，染色體拷貝的3-己酮糖-6-磷酸合成酶編碼基因hps、6-磷酸-3-己酮糖異構酶編碼基因phi以及磷酸果糖激酶編碼基因pfk的單敲除菌株，幾乎完全阻斷了甲醇代謝。這一發現表明染色體拷貝的這些基因對甲醇代謝具有重要作用，為理解甲醇芽孢桿菌的代謝機制提供了關鍵科學依據。

除了基因編輯技術，研究團隊還鑒定和評估了12個用于基因穩定整合和表達的染色體中性位點。這些中性位點在不同條件下對菌體生長影響較小，并具有不同的表達水平，為基因表達的精細調控提供了廣泛選擇。利用上述基因編輯技術與中性位點，研究團隊將對甲醇代謝至關重要的19kb大質粒pBM19整合至中性位點進行表達，同時敲除內源質粒，獲得了無質粒的新型工程底盤。通過適應性進化，該底盤展現出穩定且強健的生長特性，既避免了質粒丟失風險，也消除了菌株退化的隱患。這種穩定的工程底盤為后續的工業化應用提供了可靠的基礎，解決了傳統質粒依賴型菌株在長期培養中容易退化的問題。

甲醇芽孢桿菌作為一種獨特的嗜熱且質粒依賴型的甲基營養菌，其最適生長溫度高達50–55°C，并能在海水培養基中快速生長。高溫發酵可降低冷卻能耗、減少雜菌污染、提高反應效率并節約淡水資源，這使得甲醇芽孢桿菌在工業應用中具有顯著優勢。天津工生所研究團隊構建了甲醇芽孢桿菌的基因組規模代謝網絡模型iBM822，并將其整合至CAVE和QHEPath等途徑可視化與途徑設計云平臺上，方便研究人員使用。利用該模型模擬預測了甲醇芽孢桿菌代謝甲醇合成L-精氨酸的代謝途徑，并通過基因敲除和過表達研究了L-精氨酸合成的調控機制，構建得到利用甲醇生產L-精氨酸的初代工程菌。該工作得到國家重點研發計劃、國家自然科學基金、天津市杰出青年科學基金等項目的支持。

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