精準(zhǔn)病理新方向，從IHC到mIHC，伴隨診斷正邁入空間病理學(xué)時(shí)代！

伴隨診斷技術(shù)正經(jīng)歷從傳統(tǒng)免疫組化（IHC）向多重?zé)晒饷庖呓M化（mIHC）的革命性跨越，這一變革深刻反映了精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代對(duì)腫瘤微環(huán)境多維解析的迫切需求。

在之前的精準(zhǔn)病理系列文章中，我們圍繞Claudin18.2、MET、ALK、FRα、MAGE-A4、MMR、PD-L1、HER2等多個(gè)核心蛋白靶標(biāo)，詳細(xì)拆解了免疫組化（IHC）技術(shù)在精準(zhǔn)病理伴隨診斷中的核心價(jià)值，為醫(yī)生制定治療方案提供了關(guān)鍵依據(jù)。

然而，隨著對(duì)腫瘤微環(huán)境認(rèn)識(shí)的不斷深入，單一蛋白靶標(biāo)分析的局限性日益凸顯，無(wú)法全面揭示疾病的復(fù)雜病理生理狀態(tài)。因此，多重?zé)晒饷庖呓M化（mIHC）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，它可以在一張組織切片上進(jìn)行多個(gè)蛋白靶標(biāo)染色，通過(guò)各靶標(biāo)在細(xì)胞上的單表達(dá)或共表達(dá)，識(shí)別不同細(xì)胞亞群的空間關(guān)系，正逐步成為伴隨診斷領(lǐng)域的新寵。

▲ IHC單重染色 vs. mIHC多重染色

今天，我們來(lái)聊聊伴隨診斷技術(shù)從IHC到mIHC的進(jìn)化之路。

01

IHC臨床價(jià)值與固有局限

IHC技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，憑借其操作簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀且可靠的特點(diǎn)，在腫瘤病理診斷中占據(jù)了不可替代的地位。它通過(guò)抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，能夠在組織切片上精準(zhǔn)定位目標(biāo)蛋白，為腫瘤分型、預(yù)后評(píng)估及治療選擇提供了重要依據(jù)。

IHC技術(shù)成功地將眾多生物標(biāo)志物，如Claudin18.2、MET、ALK、FRα、MAGE-A4、MMR、PD-L1、HER2等，從實(shí)驗(yàn)室推向了臨床常規(guī)檢測(cè)，成為伴隨診斷的基石。

然而，IHC的局限性也顯而易見(jiàn)：?jiǎn)未螜z測(cè)僅能標(biāo)記一個(gè)蛋白靶標(biāo)，難以全面反映腫瘤微環(huán)境中多種蛋白質(zhì)之間的相互作用和空間關(guān)系。腫瘤微環(huán)境猶如一個(gè)高度復(fù)雜且精密的生態(tài)系統(tǒng)，其復(fù)雜性遠(yuǎn)非單個(gè)蛋白表達(dá)所能涵蓋。例如，要評(píng)估免疫治療的真實(shí)潛力，我們需要同時(shí)了解多個(gè)蛋白標(biāo)志物的復(fù)雜表達(dá)模式，如腫瘤細(xì)胞上的PD-L1表達(dá)、周圍浸潤(rùn)免疫細(xì)胞（如CD8+ T細(xì)胞等）的數(shù)量、定位及其功能狀態(tài)。

值得注意的是，IHC可雙染，即對(duì)同一組織切片進(jìn)行兩種不同標(biāo)志物的染色，然后通過(guò)視覺(jué)評(píng)估。通常，DAB（棕色）顯色劑用于標(biāo)記一個(gè)蛋白靶標(biāo)，萘酚/快紅（或其他紅色顯色劑）用于標(biāo)記另一個(gè)蛋白靶標(biāo)。因此，IHC雙染我們也常稱之為明場(chǎng)mIHC。IHC雙染的局限性在于，需選擇不同種屬一抗，且當(dāng)顯色劑在同一共定位的細(xì)胞區(qū)室中重疊時(shí)，很難確定是否存在雙重標(biāo)記，因?yàn)槲怙@色劑會(huì)結(jié)合形成顏色不確定的暗信號(hào)。最重要的是，與熒光染料相比，明場(chǎng)顯色劑相對(duì)較少且吸收光譜比熒光基團(tuán)更寬，這也意味著明場(chǎng)多重很容易光譜重疊和串色。

因此，傳統(tǒng)IHC若要檢測(cè)多種蛋白標(biāo)志物，往往需通過(guò)連續(xù)切片重復(fù)染色流程。這不僅造成組織樣本的浪費(fèi)，更關(guān)鍵的是無(wú)法捕捉蛋白的原位空間關(guān)聯(lián)——如同我們僅能看到散落各處的拼圖碎片，始終無(wú)法拼湊出完整的疾病全貌。該局限性在免疫治療、靶向治療耐藥機(jī)制研究中尤為顯著，也使得伴隨診斷技術(shù)的升級(jí)迭代迫在眉睫。

▲ 傳統(tǒng)單重IHC無(wú)法在一張切片上同步展示多維信息

02

mIHC開(kāi)啟空間蛋白解析時(shí)代

多重?zé)晒饷庖呓M化（mIHC）正在悄然改變游戲規(guī)則。如果說(shuō)IHC是病理診斷的『?jiǎn)吸c(diǎn)探測(cè)儀』，那mIHC就是『全景雷達(dá)』。

▲ mIHC開(kāi)啟空間蛋白解析新時(shí)代

作為IHC技術(shù)的進(jìn)階形態(tài)，mIHC最主（成）流（熟）技術(shù)是通過(guò)酪胺信號(hào)放大（TSA）原理（即利用辣根過(guò)氧化酶HRP標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，HRP在過(guò)氧化氫環(huán)境下催化激活熒光標(biāo)記的酪胺分子，使熒光底物與抗原表位酪氨酸殘基共價(jià)結(jié)合形成大量熒光信號(hào)），使用多色熒光標(biāo)記不同抗體（每個(gè)熒光染料都有自己特定的發(fā)射光譜），能在同一張組織切片上同時(shí)檢測(cè)多種生物標(biāo)志物，清晰呈現(xiàn)它們的空間分布和相互作用關(guān)系。因此，mIHC（TSA）也常稱之為熒光場(chǎng)mIHC。

▲ mIHC技術(shù)原理（對(duì)比IHC技術(shù)）

▲ mIHC TSA放大機(jī)制

▲ mIHC多重染色效果圖

這一技術(shù)突破，不僅大大提高了檢測(cè)效率，更通過(guò)保留空間位置信息，揭示了腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞間的復(fù)雜相互作用。簡(jiǎn)言之，mIHC與單重IHC的主要區(qū)別在于，能夠檢測(cè)和區(qū)分組織結(jié)構(gòu)背景中的多個(gè)蛋白質(zhì)靶標(biāo)，同時(shí)不丟失形態(tài)或空間信息。

mIHC相較于IHC的優(yōu)勢(shì)有：

? 突破一抗種屬限制問(wèn)題；

? 減少組織樣本消耗（特別是小活檢/稀有樣本）；

? 原位實(shí)現(xiàn)多蛋白共檢和共定位，保留空間信息；

? 揭示細(xì)胞間相互作用、組織結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)；

? TSA放大，可提高低豐度蛋白的檢測(cè)靈敏度；

? IHC為半定量分析，mIHC可精準(zhǔn)定量分析；

? mIHC比多輪IHC更具成本效益和時(shí)間效率，減少試劑及實(shí)驗(yàn)室資源的消耗。

綜合而言，mIHC可以解決許多科學(xué)問(wèn)題，包括臨床、轉(zhuǎn)化和基礎(chǔ)研究應(yīng)用。這一技術(shù)有望在伴隨診斷開(kāi)發(fā)中占據(jù)重要地位。

03

mIHC在藥物臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用

盡管目前尚未有用于多重生物標(biāo)志物檢測(cè)的mIHC伴隨診斷產(chǎn)品獲批，但全球范圍內(nèi)的臨床試驗(yàn)和企業(yè)合作，正在為其伴隨診斷落地應(yīng)用鋪路。

近年來(lái)，mIHC技術(shù)在藥物臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用日益廣泛，成為評(píng)估藥物療效和預(yù)測(cè)患者反應(yīng)的重要工具。目前，美國(guó)國(guó)家癌癥研究所（NCI）將其納入腫瘤免疫療法臨床試驗(yàn)指南（CIMACs-CIDC），全球頂尖藥企也紛紛采用該技術(shù)推進(jìn)創(chuàng)新療法與伴隨診斷產(chǎn)品研發(fā)。

以Akoya Biosciences（現(xiàn)被Quanterix收購(gòu)）為例，該公司與多家藥企合作，利用其先進(jìn)的mIHC技術(shù)平臺(tái)，開(kāi)展了多項(xiàng)靶向/免疫藥物的臨床試驗(yàn)。其中，最重要的進(jìn)展是在2022年6月28日，Akoya Biosciences與Acrivon Therapeutics宣布合作，共同開(kāi)發(fā)、驗(yàn)證和商業(yè)化Acrivon的OncoSignature測(cè)試（這是一款基于mIHC技術(shù)所開(kāi)發(fā)的前所未有的伴隨診斷產(chǎn)品），該測(cè)試將用于識(shí)別對(duì)CHK1/2抑制劑ACR-368治療最有可能產(chǎn)生反應(yīng)的癌癥患者。

▲ Akoya與Acrivon合作開(kāi)發(fā)首個(gè)mIHC伴隨診斷產(chǎn)品

2023年11月28日，美國(guó)FDA授予了ACR-368 OncoSignature測(cè)試的突破性設(shè)備認(rèn)證，這是一款用于識(shí)別可能從ACR-368治療中受益的卵巢癌患者的mIHC檢測(cè)產(chǎn)品，也是mIHC產(chǎn)品首次獲得FDA的突破性醫(yī)療器械認(rèn)證。

2025年2月5日，美國(guó)FDA授予了ACR-368 OncoSignature測(cè)試的突破性醫(yī)療器械認(rèn)證，這是FDA第二次認(rèn)定，用于識(shí)別可能從ACR-368治療中受益的子宮內(nèi)膜癌患者。該認(rèn)定也反映了FDA的判斷，即該設(shè)備有望為危及生命或造成不可逆轉(zhuǎn)的削弱人類健康狀況的疾病或狀況提供更有效的治療或診斷。

▲ OncoSignature測(cè)試：基于mIHC技術(shù)所開(kāi)發(fā)的多種生物標(biāo)志物檢測(cè)產(chǎn)品，對(duì)FFPE樣本的多色圖像定量分析，如果所有3個(gè)生物標(biāo)志物評(píng)分都高于預(yù)定閾值，則樣品被確定為OncoSignature陽(yáng)性。

目前來(lái)看，若ACR-368藥物和ACR-368 OncoSignature Assay一旦同步獲批，mIHC技術(shù)將迎來(lái)臨床應(yīng)用爆發(fā)點(diǎn)。

mIHC正逐步成為伴隨診斷領(lǐng)域的新寵。

當(dāng)前，行業(yè)內(nèi)對(duì)于mIHC panel的檢測(cè)，若panel檢測(cè)≤9色，則稱之為多重檢測(cè)；若panel檢測(cè)>9色，則稱之為超多重檢測(cè)。一項(xiàng)HPK1抑制劑NDI-101150（臨床前數(shù)據(jù)顯示，HPK1抑制劑即使在免疫抑制條件下也可能激活T細(xì)胞、B細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的抗腫瘤活性）的臨床試驗(yàn)中使用了『多重+超多重』的檢測(cè)方法：2重（CD3, pSLP76）+12重（Ki67, GrzB, Lag3, CD8, PD-1, FoxP3, CD11c, CD3, CD4, CD20, pan-CK），對(duì)治療前和治療后患者的4um厚FFPE樣本進(jìn)行mIHC檢測(cè)評(píng)估。

研究發(fā)現(xiàn)：1）腫瘤活檢mIHC證實(shí)治療期間pSLP76的抑制；2）通過(guò)mIHC 12重組織免疫表型分析觀察到的CD8+ T細(xì)胞招募和激活增強(qiáng)，支持了NDI-101150通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境發(fā)揮作用的假設(shè)。

▲ HPK1抑制劑：mIHC多重+超多重的臨床試驗(yàn)

此外，mIHC技術(shù)還可以在單張切片上同時(shí)實(shí)現(xiàn)蛋白和RNA共檢，如單RNA檢測(cè)或RNAscope等。

目前，有上百項(xiàng)關(guān)鍵臨床試驗(yàn)中采用了mIHC的空間蛋白組學(xué)技術(shù)，也表明了空間特征可作為預(yù)后和預(yù)測(cè)治療獲益的指標(biāo)。預(yù)計(jì)在近1-2年內(nèi)，mIHC臨床試驗(yàn)將從小型探索性研究向大規(guī)模注冊(cè)研究過(guò)渡，最終走向臨床應(yīng)用。

04

mIHC技術(shù)已就位，未來(lái)正當(dāng)時(shí)

2025年12月19日，國(guó)家醫(yī)保局印發(fā)《病理類醫(yī)療服務(wù)價(jià)格項(xiàng)目立項(xiàng)指南（試行）》，其中28項(xiàng)指南明確三項(xiàng)可加收項(xiàng)，第20項(xiàng)特別指出：。這一舉措，無(wú)疑是國(guó)家醫(yī)保局對(duì)mIHC項(xiàng)目加收的明確支持，一次檢測(cè)鎖定多個(gè)靶點(diǎn)，為精準(zhǔn)醫(yī)療筑牢堅(jiān)實(shí)保障。

▲ 國(guó)家醫(yī)保局：IHC檢測(cè)可以加收多重染色

其實(shí)，這一政策出臺(tái)早有端倪。早在2023年9月28日，國(guó)家衛(wèi)健委、國(guó)家中醫(yī)藥局和國(guó)家疾病預(yù)防控制中心三大權(quán)威機(jī)構(gòu)聯(lián)合發(fā)布《全國(guó)醫(yī)療服務(wù)項(xiàng)目技術(shù)規(guī)范（2023年版）》，將『多色免疫熒光檢測(cè)』及『數(shù)字化熒光病理切片掃描』正式納入國(guó)家級(jí)醫(yī)療服務(wù)收費(fèi)項(xiàng)目名單。這不僅代表著國(guó)家主管部門對(duì)mIHC臨床價(jià)值的高度認(rèn)可，更為各省市申請(qǐng)mIHC收費(fèi)提供了有力依據(jù)。

此次醫(yī)保局指南進(jìn)一步明確加收政策，形成政策閉環(huán)，標(biāo)志著mIHC行業(yè)進(jìn)入規(guī)范化發(fā)展快車道。

政策東風(fēng)下，提前布局mIHC全產(chǎn)業(yè)鏈、手握核心產(chǎn)品注冊(cè)證（包括多色顯色試劑盒，全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)，多光譜數(shù)字病理掃描儀/熒光明場(chǎng)多功能數(shù)字病理掃描儀和mIHC智能分析軟件）的企業(yè)將率先搶占先機(jī)。

隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步和成本的逐步降低，mIHC技術(shù)有望在伴隨診斷領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。未來(lái)，mIHC技術(shù)將不僅僅局限于腫瘤治療領(lǐng)域，還將拓展至自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病等多個(gè)領(lǐng)域。同時(shí)，隨著人工智能和大數(shù)據(jù)技術(shù)的融入，mIHC技術(shù)將實(shí)現(xiàn)更高水平的自動(dòng)化和智能化分析，為精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展注入新的動(dòng)力。

從IHC到mIHC，伴隨診斷技術(shù)正經(jīng)歷著從單分子分析到多維度、空間定位分析的深刻變革。mIHC技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，正在逐步成為腫瘤精準(zhǔn)治療的重要工具。未來(lái)，隨著技術(shù)的不斷完善和應(yīng)用場(chǎng)景的拓展，mIHC技術(shù)將為更多患者帶來(lái)福音，開(kāi)啟精準(zhǔn)醫(yī)療的新篇章。

參考資料：

1.Harms PW, Frankel TL, Moutafi M, Rao A, Rimm DL, Taube JM, Thomas D, Chan MP, Pantanowitz L. Multiplex Immunohistochemistry and Immunofluorescence: A Practical Update for Pathologists. Mod Pathol. 2023 Jul;36(7):100197.

2.Tan WCC, Nerurkar SN, Cai HY, Ng HHM, Wu D, Wee YTF, Lim JCT, Yeong J, Lim TKH. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commun (Lond). 2020 Apr;40(4):135-153.

3.https://dctd.cancer.gov/research/networks/precision-medicine-oncology/cimac-cidc

4.Sheng W, Zhang C, Mohiuddin TM, Al-Rawe M, Zeppernick F, Falcone FH, Meinhold-Heerlein I, Hussain AF. Multiplex Immunofluorescence: A Powerful Tool in Cancer Immunotherapy. Int J Mol Sci. 2023 Feb 4;24(4):3086.

5.https://acrivon.gcs-web.com/news-releases/news-release-details/akoya-biosciences-partner-acrivon-therapeutics-clinical

6.https://ir.acrivon.com/news-releases/news-release-details/acrivon-therapeutics-announces-fda-has-granted-breakthrough

7.https://ir.acrivon.com/news-releases/news-release-details/acrivon-therapeutics-announces-fda-has-granted-breakthrough-0

8.Locke D, Hoyt CC. Companion diagnostic requirements for spatial biology using multiplex immunofluorescence and multispectral imaging. Front Mol Biosci. 2023 Feb 9;10:1051491.

9.https://www.decibio.com/market-reports/spatial-biology-market

10.Sun AK, Fan S, Choi SW. Exploring Multiplex Immunohistochemistry (mIHC) Techniques and Histopathology Image Analysis: Current Practice and Potential for Clinical Incorporation. Cancer Med. 2025 Jan;14(1):e70523.

11.http://www.nhsa.gov.cn/art/2025/12/19/art_14_19084.html