J Cell Biol | 孟安明團隊開發(fā)斑馬魚時空特異性基因編輯系

基因編輯技術(shù)的 迅速發(fā)展 為 解析復(fù)雜發(fā)育過程中的基因功能 提供了 重要工具 。然而， 相關(guān)技術(shù) 在 斑馬魚中的應(yīng)用仍存在一些局限性 ： 例如 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的全胚基因敲除 往往 導(dǎo)致胚胎 早期 死亡，而 Cre/ loxP 條件性敲除系統(tǒng)則受限于 loxP 序列的 種系敲入 效率 率及位點 的 限制 等因素的影響 。上述 問題在一定程度上阻礙了針對 斑馬魚時空特異性發(fā)育調(diào)節(jié)機制的 深入研究 。

近日 日 ，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院孟安明課題組在Journal of Cell Biology發(fā)表題為 “ 通過 4-OHT 誘導(dǎo)型 Cas9 在整胚中實現(xiàn) 時期及 組織特異性基因編輯 ”

Stage- and tissue-specific gene editing using 4-OHT

inducible Cas9 in whole organism

研究 團隊基于 4- 羥基他莫昔芬 （ 4-hydroxytamoxifen ， 4-OHT ） 與 突變 型 雌激素受體（ estrogen receptor, ER ）構(gòu)建了 4-OHT 誘導(dǎo)型 Cas 9 蛋白 n Cas9 ER T2 ， 并 在 HEK293T 細胞系 中驗證 其在 4 -OHT 處理 后可誘導(dǎo) n Cas9 ER T2 蛋白 入核 進行 基因編輯。隨后，研究人員構(gòu)建了 生殖細胞 系 特異 表達 誘導(dǎo)型 Cas 9 蛋白 轉(zhuǎn)基因 斑馬魚 品系 Tg (piwil1: n Cas9 ERT2 -n3U) 和 泛 表達 g RNA 轉(zhuǎn)基因 斑馬魚 品系 Tg (U6:gRNA s , cryaa:CFP) 。實驗結(jié)果表明， 該誘導(dǎo)型 n Cas9 ER T2 蛋白在斑馬魚胚 胎 原始生殖細胞（ PGCs ） 及雌魚卵母細胞中均 成功響應(yīng) 4-OHT 誘導(dǎo)， 實現(xiàn)時期及組織特異性基因編輯。 與 傳統(tǒng)的 組織特異性基因 編輯 系統(tǒng)相比 ， 該系統(tǒng) 通過控制基因編輯 的 時間，有效避免 了 早期 胚胎 體細胞 脫靶 編輯 ， 凸顯該技術(shù)在胚胎早期 P GC s 研究中的重要價值 。 利用該系統(tǒng)， 研究人員 進一步 探究了 tbx 16 基因在 PGC 遷移過程中的功能，發(fā)現(xiàn) P GC 特異敲除 tbx 16 基因會影響 P GC 遷移， 為 理解 tbx16 在斑馬魚胚胎發(fā)育中的功能 提供了新的實驗證據(jù) ， 并 拓展了對 其 參與斑馬魚 P GC 發(fā)育過程 調(diào)控 的認知。

該時空特異性基因編輯系統(tǒng)及轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系模式圖

清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 吳小童 副研究員 及孟安明院士 為本文通訊作者； 2024 屆博士畢業(yè)生李雅琪 、 2025 屆博士畢業(yè)生張渭瑩、危子航為本文的共同第一作者 ；博士研究生李晗、圖爾蓀江·艾則孜、 博士后 劉鑫 與 鄭濤 等 在 該研究 做出 重要貢獻； 北京科技 大學(xué) 幸岑璨 副教授 參與 了 課題指導(dǎo) 。

論文鏈接：https://doi.org/10.1083/jcb.202412216

制版人：十一

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