CAR-T設計的核心是蛋白工程

近日，吉利德宣布，擬以78億美元（溢價約80%）的價格收購細胞療法公司Arcellx。此前，吉利德旗下Kite Pharma與Arcellx合作，共同開發并銷售一種用于多發性骨髓瘤（MM）的實驗性CAR-T療法（Anito-cel）。

Anito-cel已完成關鍵性2期注冊臨床研究（iMMagine-1），并獲得FDA受理上市申請，PDUFA目標日期（審批決議截止日）為 2026年12月23日。

根據已披露的臨床數據，Anito-cel展現出了優于明星產品Carvykti的潛力（表1），這也是促使吉利德高價收購Arcellx的重要原因。

表1. Anito-cel與Carvykti臨床數據對比

如果比較Anito-cel與Carvykti的CAR設計可以發現兩者最大的不同是胞外的抗原結合部分：Carvykti選擇了兩個VHH串聯，而Anito-cel則用了一個D-Domain蛋白（圖1）。

圖1. 不同BCMA CAR-T結構比較

抗原結合部分的不同，很可能是導致兩款CAR-T在臨床上不同表現的根本原因。通過比較Anito-cel與Carvykti抗原結合部分的分子設計，凸顯了蛋白工程在CAR-T設計中的核心地位。

1、Tonic Signaling

在CAR-T細胞療法中，抗原非依賴性信號（Tonic Signaling）被稱為T細胞的“慢性疲勞綜合征”。它是指CAR-T細胞在沒有接觸到腫瘤抗原的情況下，自發產生的持續性激活信號。這種現象是導致CAR-T療法失效（尤其是持久性差）的核心原因之一。

Tonic Signaling的根源在于CAR分子胞外結合域（通常是scFv）的結構不穩定，易自發聚集（Self-aggregation）。傳統的scFv由重鏈（VH）和輕鏈（VL）通過一段Linker連接（圖2A）。由于其疏水表面暴露或折疊不穩定，scFv分子之間傾向于像磁鐵一樣互相吸引并聚集在一起。

圖2. (A) scFv；(B) VHH；(C) D-Domain結構示意圖

當胞外的結合域發生聚集，胞內的信號域（如CD3和4-1BB/CD28）也會隨之靠攏并發生磷酸化。這欺騙了T細胞，讓它以為自己正在攻擊腫瘤。

這種持續的低水平背景信號對T細胞具有毀滅性影響：（1）引起早期耗竭（Exhaustion）： T細胞長期處于“待機即工作”的狀態，導致表型從記憶性向終末分化型轉變，高表達PD-1、LAG-3等抑制性受體；（2）擴增能力受限：當真正的腫瘤抗原出現時，這些已經“疲憊不堪”的T細胞無法進行強有力的克隆擴增；（3）分化失衡：細胞過早失去干性（Stemness），導致其在體內的存續時間（Persistence）大幅縮短。

在BCMA CAR-T的三劍客中，BMS的Abecma被公認為擁有最高水平的Tonic Signaling，這也是其在臨床數據（尤其是PFS）上顯著落后于Carvykti和Anito-cel的結構性根源。而Abecma使用的正是最傳統的scFv（源自鼠源抗體序列）。

Carvykti在CAR設計上串聯了兩個VHH（VHH1和VHH2）。雖然這極大提升了親和力，但在細胞膜表面的高密度表達下，VHH的β片層結構（圖2B）以及這種長鏈串聯結構比單價結構有更高的概率發生物理碰撞或微簇化（Micro-clustering），使T細胞提前進入耗竭狀態。

研究顯示，雖然Carvykti的Tonic Signaling極低，不足以讓T細胞迅速進入耗竭狀態（這也是其PFS極長的原因），但在基底狀態下仍存在微弱的磷酸化信號。

Anito-cel的D-Domain是單鏈三α-螺旋（α3D）結構（圖2C），由美國賓夕法尼亞大學的 William F. DeGrado教授團隊于1999年計算并設計。α3D沒有scFv那種復雜的VH/VL界面和容易誘發聚集的Linker。在In Silico（計算機模擬）優化過程中，Arcellx調整了D-Domain表面的電荷分布，使分子間產生靜電排斥而非吸引。臨床前對比顯示，表達D-Domain的CAR-T細胞在靜息狀態下的磷酸化水平極低，保持了極高的“初始/記憶”表型比例。

Tonic Signaling不僅影響療效，還與毒性相關。持續的信號可能導致基底水平的細胞因子（如IFN-γ）釋放，增加患者發生非特異性炎癥風險。細胞在非腫瘤部位（如腦部）的慢性低水平激活，被認為是Carvykti產生延遲神經毒性（DNT）的誘因之一。

2、Koff

傳統的CAR-T往往追求極高的親和力，尤其是Carvykti的雙VHH（雙Epitope）設計以及產生的Avidity效果（Koff在10-4S-1數量級），一旦抓住腫瘤細胞就像“強力膠”一樣死死粘住，導致CAR-T的解離極其困難。

牢固的結合確保了T細胞能持續接收激活信號，從而誘導極深的臨床緩解（sCR達80%以上）。 但由于解離極慢，T細胞容易在表達極低水平 BCMA的非腫瘤組織（如大腦基底節）中發生非特異性累積，這被認為是造成Carvykti約10%延遲性神經毒性的核心機制。

而Anito-cel的D-Domain被設計為“快進快出”（Koff在10-2S-1數量級），它能迅速識別并結合BCMA觸發殺傷信號，但在完成任務后會快速解離。

因此，單個CAR-T細胞可以像“連環殺手”一樣，在極短時間內連續攻擊多個腫瘤細胞，而不是被困在第一個目標的殘骸上。這就是為什么它即使在劑量較低時，也能達到90%以上的總緩解率 (ORR)。

傳統CAR-T的長時間的強力結合會導致T細胞持續釋放超生理水平的細胞因子（如IL-6），形成失控的正反饋。Anito-cel的快解離特性限制了單次結合誘發的細胞因子釋放強度。這種“點到為止”的激活方式足以殺死腫瘤，但不足以引發嚴重的CRS（表2）。

表2. Anito-cel與Carvykti的機制對比

此外，血液中存在大量的游離BCMA，快解離的D-Domain不會被這些“游離靶點”永久鎖定，從而保持了在骨髓病灶中的滲透能力。

MM髓外疾病患者（EMD）通常預后極差，對常規CAR-T響應較低。在Anito-cel iMMagine-1的EMD亞組中，24個月PFS率仍達57.5%。而Carvykti在EMD患者中的PFS僅8.1個月（CARTITUDE-1）。

3、免疫原性

在CAR-T療法中，免疫原性（Immunogenicity）是決定藥物“長效”的隱形防線。如果說療效決定了CAR-T能跑多快，那么免疫原性就決定了它能跑多遠。

如果CAR分子（如鼠源scFv）被識別為異物，患者體內會產生抗藥物抗體 (ADA) 。這些抗體像“導彈攔截系統”一樣，在CAR-T細胞還沒開始大規模殺傷腫瘤前就將其從循環中清除。

除了體液免疫（抗體），宿主的T細胞（CTL）也會攻擊表達異源蛋白的 CAR-T細胞。這種內耗會導致CAR-T細胞無法達到預期的峰值濃度 (Cmax)，直接削弱了對高腫瘤負荷患者的殺傷力。

Carvykti的VHH雖然經過高度人源化，但其復雜的雙VHH結構和Linker仍可能被免疫系統識別。在CARTITUDE-1研究中，約19%的患者出現了ADA。

D-Domain基于α3D合成蛋白，根據Arcellx披露的專利數據，α3D本身在計算生物學評分中具有極低的固有免疫原性分數。

Arcellx通過掃描整個D-Domain氨基酸序列，尋找可能與人類主要的HLA II類分子（MHC-II）高親和力結合的片段（即T細胞表位）。這種預測覆蓋了全球95%以上人口的各種等位基因，確保其在不同族裔中都具有極低的排異風險。

Arcellx然后在D-Domain噬菌體展示庫的構建階段，直接在DNA水平上通過定向誘變（Targeted Mutagenesis）替換掉那些高風險的氨基酸（De-immunization）。 同時使用計算模型驗證這些替換是否會破壞三螺旋結構的穩定性或降低對BCMA的親和力。如果一個變體的免疫原性分數過高，它將在進入臨床前被直接剔除。

最后通過第三方驗證（如Abzena的EpiScreen平臺），通過將去免疫原化后的D-Domain與來自不同健康捐贈者的T細胞共同培養，觀察其實際引發的T細胞增殖反應。數據證明，D-Domain的免疫原性甚至可以低至重組人源化抗體（如Herceptin）水平。

Anito-cel的設計確保了其序列片段與人類MHC-II分子的親和力極低，從而切斷了被免疫系統“標記”的路徑。臨床數據顯示，Anito-cel在回輸12-24個月后仍表現出極強的細胞活性。

根據iMMagine-1研究數據，Anito-cel擴增曲線表現出更好的穩健性。由于“快解離”和“低免疫原性”的雙重作用，其細胞在體內的表型更偏向于記憶性T細胞 (Memory T cells)，這類細胞不僅擴增能力強，且在體內存活時間更久。

而Carvykti則表現為“爆發式”擴增，峰值極高，但由于其高親和力導致的持續刺激，部分細胞會較快進入耗竭階段。

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