小分子量蛋白（11KD）WB 實驗艱辛歷程及經驗總結

個人工作多年以后再回來讀博的，所以實驗技術什么的從頭學起，這其中 WB 走的彎路最多，現在就和大家聊聊我個人的歷程，并交流一下自己的經驗。這個經驗是我跑一個 11KD 分子量分泌性蛋白得出的，肯定不會適用于所有情況，但是受困于小分子量蛋白 WB 的朋友還是很多，所以聊勝于無，在此分享一下。

我搞的蛋白質是一個 11KD 的分泌性蛋白，并且是我實驗設計中一個重要的指標，最初學習 WB 技術，受困于二抗不合格一直連內參都做不出來......后面改換抗體之后，才相對順利一點，其他指標也相繼出來了。所以，抗體真的很重要。

但是在做 WB 實驗的 7、8 個月過程中，核心的一個蛋白一直處于混沌狀態，可能跑 30 次能現身一次，現身之后又沒影好幾個月，就這樣捉摸不定，搞得我很煩，但又無可奈何。詢問了實驗室的同學們，說法各一：

1、有人說小分子量蛋白就是難跑，為什么難大家也說不清楚。

2、有的說分泌性蛋白本身胞內含量少，不好跑，需要加大上樣量，似乎也是實話。

3、還有的說小分子量蛋白容易降解，你的蛋白質降解了吧，我姑且信了。但是 95% 的時候我跑出的條帶都是大白板，縱然我通過 PCR、細胞的免疫熒光都能夠發現這個蛋白，但是就是 WB 做不出來。

4、也有朋友告訴我說分泌型蛋白你還是做 ELISA 吧，可是一來這個蛋白的 ELISA 試劑盒好貴的，二來我就是想做 WB。所以就開始了上下求索之路。95% 的時間跑出來的條帶是這樣的……

（圖：實驗條帶）

這一求索就是幾個月的時間。期間一直覺得電泳沒什么技術含量，電轉的過程才是重點，于是糾結于電轉條件，也糾結過電轉液的配置等。再次翻閱丁香園論壇里面大神的回帖，其中一個大神提到：小分子量蛋白容易在電泳過程中彌散，電泳在壓縮膠里多壓一會，在分離膠里面跑一半就好了。對這個話百思不得其解，于是開始查詢一些實驗技術方面的文獻，其中有幾篇文獻對我很有啟發，有些技術原理方面的內容如下：

在含 SDS 緩沖液的樣品中，小分子多肽的濃縮是較困難的，因為小分子多肽與 SDS 形成的復合體具有與 SDS 本身類似的電荷和大小，所以偏離了相對遷移率和分子質量對數的相互關系，因此濃縮對于小分子多肽的 SDS-PAGE 來說就成了一個突出問題。

于是回去翻了翻自己曾經偶然跑出來的條帶的模樣，給我的感覺就是壓縮的不好，然后還有彌散的現象（就是那種蛋白暈開的模樣，例如這條帶下面的波浪邊緣，當然也可能是膠不均勻的原因吧，反正我當時就覺得是彌散的現象）。

（圖：實驗條帶）

然后我就突然有種恍然大悟的感覺，也許說的不對，但是我個人的感覺是：

一般較大的分子量的蛋白（如 20-70KD）與上樣緩沖液中的 SDS 結合后，因為本身蛋白分子大，SDS 附著在上面之后，還是和膠里面的 SDS 成分有較大差異的，那么在一定電流方向的作用下，就能夠順著電流方向向下電泳；而小分子蛋白被 SDS 包裹結合形成復合物后，因為蛋白分子小，包裹上 SDS 后就和膠里面本身的 SDS 差別沒那么大了，那么此時就算有電流作用，它也不會那么聽話的順流而下，畢竟和周遭的膠里面的 SDS 區別不大，在電泳向下走的過程中，可能向其他方向混亂的運動，走著走著就暈染開了，就像墨點到宣紙上一樣。

所以回到前面大神說的話，讓多壓一會，那么就是為了讓小分子蛋白盡量聚集；少電泳一會，就是稍微跑開 marker 之后，能夠分開小分子蛋白和內參即可，加入跑多了，例如溴酚藍跑到下沿 1 cm 以上的位置，那時候可能小分子蛋白就又暈染開消失在膠里面了，這樣的話一抗也就不能識別那么彌散的蛋白了。（專業人士原諒我粗淺的認識哈，也許不對，但是我理解的就是這樣，我就是打個比方讓其他的科研小白能理解。）

然后在論壇里面還看到一個建議就是用 0.2% 的戊二醛固定轉膜完成后的條帶 45 分鐘，再進行后續封閉漂洗等步驟，為的就是防止小分子蛋白在后續操作中洗脫了。于是乎說干就干，開始了我再次改進的實驗歷程，說來簡單，實際上從 25 號到 1 號，一共 8 天時間，我大概做了 12 次 WB，終于能夠重復出來結果了。要點如下：

1、電轉液中一定不要加 SDS。對于大分子量蛋白加入 SDS 是為了增加轉膜效率，道理上是增加了蛋白表面電荷。而對于小分子量蛋白，SDS 千萬不能加，否則會封閉小分子蛋白的抗原位點。（我忘記從哪里看到的了，文獻不能在這里給出，大家勿吐槽我哈。）

2、從最開始糾結于電轉過程，使勁摸索電轉條件，現在發現電泳過程同樣很重要啊。電轉的時候其實只要預染 marker 轉到膜上了，那么你相應分子量的目的蛋白也就轉過去了，所以這就是你摸索條件的指示帶。

3、電泳過程中有推薦 TRICINE-SDS-PAGE 膠來進行電泳，會更有利于小分子量蛋白的分離，研讀了一些文獻，這個效果應該還是很肯定的，但是鄙人沒有做過這種電泳，所以給不了什么經驗，我最終還是用普通 SDS-PAGE 膠做出來的，不過鑒于我的蛋白分子量是 11KD，那么假如你是幾 KD 甚至更小分子量的多肽，那么還是建議你用 TRICINE-SDS-PAGE 膠來電泳吧。

4、在我用 SDS-PAGE 膠進行電泳過程中，一直以來都是按照說明書配制壓縮膠和分離膠的，并且在說明書中，以配置 2 塊膠為例，分離膠說明書中是讓配置 10 ml，壓縮膠是 3 ml。我一直以為是對應關系，在這次大悟之后我發現分離和壓縮完全不是一對一對應關系，人家只是給了你配置這么多體積膠的配方而已，雖然在一個縱列上，但是絕不是對應關系。（我確實才覺悟，高手輕鄙視哈。）

5、接上一條經驗，所以我在配膠過程中，下層分離膠配制了 10 ml，但是實際上每塊玻板里面只加了大概 3.5 ml 吧，也就是整個玻板高度的 60-70% 的樣子。然后壓縮膠配了 6 ml，玻板填滿插梳子，等凝固。這里我就是想讓我的小分子蛋白盡量在濃縮膠里面多濃縮、壓扁，這樣后續再分離膠里面，即使彌散一些，也總還有剩下的。

6、電泳開始，在濃縮膠層里面跑的時候，我是 60-70V 電壓，跑了大概快一個小時，反正就是溴酚藍都集中在上下層膠的那個界面的位置，并且在界面那里好半天都不動了，那么這個過程我理解就是小分子量蛋白雖然表面電荷和膠里面的 SDS 相當，但是終究還是會沿著電流方向定向移動的，所以就多壓一會吧。然后開始調整電壓為 110-120V 在分離膠里面跑，我是跑到分離膠一半的位置就停止電泳了，這時候 marker 已經分開一些了。

7、接上一條，marker 分開了一些，但是實話說分的并不好，你如果想同時測好幾個蛋白指標是很困難的，不好切膠，也不好敷條帶，所以我的建議，小分子蛋白就單獨出來跑吧。

8、電泳完成后，開始電轉，電轉過程我試過 90V 恒壓 60 分鐘，也試過 250ma 恒流 15 分鐘，對于我的蛋白都能得到滿意結果。

9、轉膜后條帶是否必須戊二醛固定？經過我的嘗試，對于我的 11KD 蛋白來說固定不固定沒有影響，那么即使固定了，戊二醛也不會影響后續的抗原抗體反應。所以各位同學們固定不固定隨意吧，假如你的蛋白分子量很小，也許 5KD 以下？那么固定一下也未嘗不可。

10、抗原抗體反應很靈敏，我的抗體在免疫熒光上面已經驗證過的，所以敷抗體的過程沒什么說的。不過抗體稀釋比例的話，我是習慣提高濃度的，說明書 1：1000，我就 1：500。這個沒有依據，純癖好，也是師兄們教的。

11、顯影這一步我覺得也有可說的。我試過多次，發現我的這個蛋白第一遍滴加顯影液后條帶不會很清晰，然后你可以把條帶拿出來就放一邊讓它反應一會，然后再放回機器里面，重新滴加顯影液顯影，效果就會好不少。還有顯影時間，結合我的示例，機器給出的自動曝光時間是 30 幾秒，我就直接加 1 分鐘改為 1 分 30 幾秒，然后就得到了下面的條帶。

第一遍顯影條帶，可以看到模糊有東西，但是不清楚，于是我拿出來放一邊反應一下。

（圖：實驗條帶）

反應幾分鐘后，我再把條帶放進機器，時間上直接增加 1 分鐘，再滴加新的顯影液，是不是好了很多。

（圖：實驗條帶）

到這里我就總結完了我的經驗和教訓。當然這 7、8 個月的摸索，還有很多想說的，但是限于篇幅和敘事能力有限，就大致總結了幾條，有些啰嗦，見諒。希望對還被小分子量蛋白 WB 折磨的朋友們有幫助。

來源：丁香園社區

站友：windkiller1984

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