Adv Sci丨北京大學(xué)王杰研究提出整合ACE-tRNA與CRISPR/Cas9技術(shù)清除HBV感染的新策略

目前針對(duì)乙肝病毒（HBV）的抗病毒藥物在實(shí)現(xiàn)慢性乙肝的功能性治愈方面仍面臨挑戰(zhàn)，因此有必要探索新的治療方法和聯(lián)合治療策略。反密碼子工程轉(zhuǎn)移RNA（ACE-tRNA）已廣泛應(yīng)用于治療由無義突變引起的遺傳疾病，但其在抗病毒治療中的作用尚未見報(bào)道。

2025年9月12日，北京大學(xué)王杰獨(dú)立通訊在Advanced Science 在線發(fā)表題為“Anticodon Engineered Transfer RNA (tRNASUAG) Inhibits Hepatitis B Virus Replication by Promoting the Degradation of Core Protein”的研究論文。該研究設(shè)計(jì)了ACE-tRNA靶向HBV核心蛋白（HBc）高度保守的終止密碼子（UAG）。

所有設(shè)計(jì)的ACE-tRNA都能讀通HBc的終止密碼子。其中，tRNASUAG可能通過在HBc的C末端結(jié)構(gòu)域引入可磷酸化的絲氨酸來促進(jìn)HBc磷酸化，從而可能降低HBc水平并通過泛素-蛋白酶體途徑促進(jìn)HBc降解來抑制HBV復(fù)制。此外，ACE-tRNA和CRISPR/Cas9技術(shù)可以通過tRNASUAG-gRNA串聯(lián)陣列有效整合，實(shí)現(xiàn)對(duì)HBV復(fù)制的聯(lián)合抑制。該研究創(chuàng)新性地利用ACE-tRNA，通過引入一個(gè)可能被翻譯后修飾的氨基酸來促進(jìn)HBc降解，從而抑制HBV復(fù)制。此外，該研究還提出了一種通過整合ACE-tRNA和CRISPR/Cas9技術(shù)來促進(jìn)HBV感染清除的有前景的治療策略。

乙型肝炎病毒 (HBV) 感染仍然是全球主要的健康問題。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球約有 2.54 億人患有慢性乙型肝炎 (HBV)，約有 110 萬人死于乙型肝炎相關(guān)的終末期肝病，包括肝硬化和肝細(xì)胞癌。目前的抗乙肝藥物，包括核苷（酸）類似物和聚乙二醇干擾素 α，在實(shí)現(xiàn)慢性乙肝的功能性治愈方面仍面臨挑戰(zhàn)。因此，開發(fā)新的治療方法和聯(lián)合治療策略對(duì)于實(shí)現(xiàn) 2030 年消除病毒性肝炎的全球目標(biāo)至關(guān)重要。

乙肝病毒核心蛋白 (HBc) 在乙肝病毒復(fù)制中起著至關(guān)重要的作用，并具有與重癥肝炎相關(guān)的細(xì)胞病變效應(yīng)，使其成為治療乙肝病毒感染及其相關(guān)肝病的有希望的靶點(diǎn)。一旦乙肝病毒（HBV）前基因組RNA（pgRNA）從共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）轉(zhuǎn)錄，HBc就會(huì)從pgRNA翻譯出來，部分HBc會(huì)組裝成核衣殼。成熟的核衣殼含有松弛環(huán)狀DNA（rcDNA），可以分泌到肝細(xì)胞外形成病毒顆粒，或被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)補(bǔ)充cccDNA庫。目前，靶向HBc組裝過程的衣殼組裝調(diào)節(jié)劑（CAMs）已在臨床試驗(yàn)中得到廣泛探索。雖然CAMs可以有效抑制HBV復(fù)制，但它們也存在一定的局限性。例如，出現(xiàn)對(duì)CAMs具有抗性的HBV變異株可導(dǎo)致病毒學(xué)突破，某些CAMs誘導(dǎo)的肝損傷可導(dǎo)致丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平升高。因此，有必要開發(fā)新的低毒性和低耐藥性的靶向HBc的方法。

反密碼子改造的轉(zhuǎn)移RNA（ACE-tRNA）能夠通過修飾天然tRNA的反密碼子環(huán)，特異性識(shí)別指定的終止密碼子（UAA-赭石密碼子、UAG-琥珀密碼子或UGA-蛋白石密碼子）。ACE-tRNA能夠高效讀取功能性蛋白質(zhì)開放閱讀框（ORF）內(nèi)的提前終止（終止）密碼子（PTC），并恢復(fù)全長蛋白質(zhì)的生成。然而，天然終止密碼子很難被ACE-tRNA讀取。因此，ACE-tRNA在治療由無義突變引起的各種遺傳疾病方面具有良好的潛力，例如β-地中海貧血、囊性纖維化和杜氏肌營養(yǎng)不良癥，并且可以通過腺相關(guān)病毒（AAV）或脂質(zhì)納米顆粒遞送。

HBV基因組是約3.2kb的部分雙鏈DNA，含有4個(gè)重疊的ORF：C、P、S和X。CORF中的HBc和P ORF中的HBV DNA聚合酶均由pgRNA翻譯而來。由于C ORF與P ORF部分重疊，且在C ORF正常終止密碼子（UAG）后第6個(gè)密碼子處存在一個(gè)符合讀碼框的終止密碼子（UAA），使得C ORF的正常終止密碼子（UAG）在某些方面與PTC相似。因此，ACE-tRNA有可能讀穿C ORF的正常終止密碼子，這可能是治療HBV感染的一種潛在方法。雖然ACE-tRNA通過讀穿PTC已被廣泛應(yīng)用于治療各種遺傳性疾病，但其在抗病毒治療中的作用尚未見報(bào)道。基于RNA鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)而非特定的核苷酸序列，tRNA的5’前導(dǎo)序列和3’尾隨序列在tRNA成熟過程中分別被RNase P和RNase Z切割。這一獨(dú)特特性使tRNA能夠作為多重非編碼RNA串聯(lián)表達(dá)的支架。在成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)/CRISPR相關(guān)核酸酶9(Cas9)系統(tǒng)中，tRNA-向?qū)NA(gRNA)串聯(lián)陣列已成功在水稻(Oryza sativa)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中實(shí)現(xiàn)了多重gRNA的串聯(lián)表達(dá)。然而，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，tRNA-gRNA串聯(lián)陣列的研究尚有限。

該研究首先探討了ACE-tRNA是否能夠讀取C ORF的終止密碼子。然后，探究ACE-tRNA對(duì)HBV復(fù)制的影響及其潛在機(jī)制，并探討能否通過ACE-tRNA-gRNA串聯(lián)陣列將ACE-tRNA與CRISPR/Cas9技術(shù)有效整合，實(shí)現(xiàn)聯(lián)合抑制HBV復(fù)制。

圖1 分析針對(duì)UAG的ACE-tRNA的讀通效率（圖源自Advanced Science）

來源：iNature

參考消息：

https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202503534