Plant Journal | 河南大學(xué)苗雨晨團(tuán)隊(duì)揭示轉(zhuǎn)錄輔助因子GhVQ28與GhMYB315協(xié)同調(diào)控棉花黃萎病抗性的分子機(jī)制

棉花（Gossypium spp.）作為全球重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，是天然紡織纖維的主要來源。在我國棉產(chǎn)區(qū)，黃萎病主要是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）引起，這種土傳真菌會(huì)嚴(yán)重影響棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)。大麗輪枝菌通過分泌植物毒素破壞水分和養(yǎng)分運(yùn)輸，導(dǎo)致維管束功能障礙，最終引發(fā)葉片萎蔫、早期落葉和維管束壞死（Chen et al., 2016；Shaban et al., 2018；Billah et al., 2021）。該病原菌傳播迅速且防治手段有限，加劇了全球棉花生產(chǎn)損失。為減少黃萎病造成的棉花產(chǎn)量損失，增強(qiáng)棉花抗病性，培育抗病的棉花品種已成為當(dāng)務(wù)之急。因此，解析棉花抵抗黃萎病的分子機(jī)制對品種改良至關(guān)重要。

近日，河南大學(xué)苗雨晨教授團(tuán)隊(duì)在棉花黃萎病抗性機(jī)制研究上取得重要進(jìn)展。The Plant Journal雜志在線發(fā)表了題為The R2R3-MYB transcription factor GhMYB315 associates with GhVQ28 to enhance Verticillium wilt resistance in upland cotton by regulating phenylpropanoid metabolism的研究論文。從陸地棉（Gossypium hirsutum L.）中鑒定出一個(gè)受大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）顯著誘導(dǎo)的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子GhMYB315。通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除GhMYB315減弱了棉花對大麗輪枝菌的抗性，而過表達(dá)該基因能提高擬南芥和棉花對大麗輪枝菌的抗性。轉(zhuǎn)錄組分析表明，GhMYB315過表達(dá)棉花中苯丙烷生物合成基因顯著上調(diào)表達(dá)。代謝組學(xué)分析顯示，接種大麗輪枝菌后，GhMYB315過表達(dá)能促進(jìn)黃酮類化合物和木質(zhì)素的積累，并增加木質(zhì)素愈創(chuàng)木基和紫丁香基單體的含量。酵母雙雜交篩選發(fā)現(xiàn)含有VQ基序的蛋白GhVQ28與GhMYB315互作，在GhMYB315過表達(dá)株系中沉默GhVQ28降低了棉花對黃萎病的抗性。綜上所述，本研究揭示了GhMYB315-GhVQ28模塊通過正向調(diào)控苯丙烷代謝途徑介導(dǎo)的黃萎病抗性，為解析棉花黃萎病抗性機(jī)制提供了新見解。

1. GhMYB315的篩選與功能鑒定

為鑒定參與棉花對大麗輪枝菌抗性反應(yīng)的R2R3-MYB家族成員，我們通過PlantCARE數(shù)據(jù)庫篩選出42個(gè)同時(shí)含有水楊酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）響應(yīng)元件的棉花R2R3-MYB基因。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，篩選出的R2R3-MYB家族成員在植物進(jìn)化過程中具有保守性。表達(dá)分析顯示，接種大麗輪枝菌18天后，42個(gè)R2R3-MYB基因中有7個(gè)在感病和抗病棉花品種中均上調(diào)表達(dá)（圖S3a），其中已知GhMYB108可正向調(diào)控棉花對大麗輪枝菌的抗性（Cheng et al., 2016）。其余6個(gè)基因（GhMYB4L、GhMYB41、GhMYB61、GhMYB78、GhMYB102和GhMYB315）通過病毒誘導(dǎo)基因沉默（VIGS）技術(shù)在ZZM2棉花植株中進(jìn)行沉默，以研究其對黃萎病病程發(fā)展的影響（圖S3b、c）。接種大麗輪枝菌14天后，與TRV:00對照植株相比，TRV:GhMYB315沉默植株表現(xiàn)出嚴(yán)重的病害癥狀，包括黃化、萎蔫、落葉、病情指數(shù)增加及維管組織嚴(yán)重褐變（圖S3d-f）。因此我們選擇GhMYB315進(jìn)行后續(xù)功能研究。

圖S3 轉(zhuǎn)錄因子GhMYB315的篩選與功能鑒定

2. GhMYB315在黃萎病抗性中的功能

為研究GhMYB315在棉花抵御大麗輪枝菌中的功能，利用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制兩個(gè)敲除突變體系Ghmyb315-koGhmyb315-ko（圖3a, b）。以及兩個(gè)獨(dú)立過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系GhMYB315-OEGhMYB315-OE，GhMYB315轉(zhuǎn)錄水平較野生型（WT）提高10-20倍（圖3f）。接種大麗輪枝菌14天后，表型觀察顯示Ghmyb315-koGhmyb315-ko，包括黃化、萎蔫和落葉，而過表達(dá)株系GhMYB315-OEGhMYB315-OE（圖3c）。與野生型相比，敲除突變體的莖菌落恢復(fù)顯著升高（圖3d），維管組織褐變更嚴(yán)重（圖3e），真菌生物量更高（圖3i）。此外，敲除突變體的病情指數(shù)顯著高于野生型（圖3g）。相反，過表達(dá)株系在所有檢測指標(biāo)中均呈現(xiàn)與敲除突變體相反的趨勢，其病害癥狀輕于野生型對照（圖3d-e, 圖3g-i）。根據(jù)黃萎病分級系統(tǒng)，植株病情嚴(yán)重程度從0級到4級遞增。實(shí)驗(yàn)中，約40%野生型植株在14天時(shí)被劃分為3-4級；敲除突變體中3-4級植株比例達(dá)70%；而過表達(dá)株系中僅10%植株處于3-4級（圖3h）。這些結(jié)果表明GhMYB315能增強(qiáng)棉花對黃萎病的抗性。

圖3 GhMYB315正調(diào)控棉花黃萎病抗性

3. GhMYB315調(diào)控苯丙烷途徑響應(yīng)大麗輪枝菌侵染

通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)分析整合到苯丙烷途徑的示意圖中，突出顯示接種大麗輪枝菌后上調(diào)的代謝物或相應(yīng)基因（圖5a）。此外，莖切片染色觀察顯示，大麗輪枝菌侵染后，GhMYB315-OEGhMYB315-OE（WT）顯著增加。LC-MS分析表明，即使在未感染條件下，GhMYB315過表達(dá)株系的根皮素、(-) 表兒茶素和 (+)兒茶素含量均高于野生型，且過表達(dá)株系在接種大麗輪枝菌后這些物質(zhì)含量進(jìn)一步升高。木質(zhì)素單體分為三種類型：對羥基苯基（H）、愈創(chuàng)木基（G）和紫丁香基（S）。GC-MS分析顯示，在對照條件下野生型與過表達(dá)植株的木質(zhì)素單體含量存在差異。大麗輪枝菌侵染會(huì)影響野生型植株的單體含量，并顯著提升GhMYB315-OEGhMYB315-OE。此外，接種大麗輪枝菌后，GhMYB315-OEGhMYB315-OE/S比值較野生型呈現(xiàn)升高趨勢。綜上表明GhMYB315通過積累木質(zhì)素和黃酮類化合物增強(qiáng)棉花對黃萎病的抗性。

圖5 轉(zhuǎn)錄組與代謝物揭示GhMYB315調(diào)控類黃酮和木質(zhì)素途徑響應(yīng)黃萎病

4. 下調(diào)GhVQ28削弱了棉花黃萎病抗性

為探究GhVQ28在棉花抗黃萎病中的作用，首先檢測了接種大麗輪枝菌后TM-1和ZZM2棉花品種根部GhVQ28的表達(dá)水平。RT-qPCR分析顯示，TM-1根部在接種后1小時(shí)即出現(xiàn)GhVQ28表達(dá)水平的顯著上升，而ZZM2根部則在接種后3小時(shí)出現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)（圖7a）。進(jìn)一步通過VIGS技術(shù)抑制ZZM2棉花中GhVQ28的表達(dá)后，植株對大麗輪枝菌的敏感性增強(qiáng)（圖7b, c）。接種14天后，與TRV:00對照植株相比，TRV:GhVQ28沉默植株出現(xiàn)更嚴(yán)重的黃化、萎蔫和落葉等病害癥狀（圖7b）。病情分級統(tǒng)計(jì)表明，TRV:GhVQ28植株中約40%達(dá)到3/4級病害程度，而對照組這一比例僅為20%（圖7d）。此外，TRV:GhVQ28植株的病情指數(shù)顯著升高，維管褐變更嚴(yán)重，莖稈真菌恢復(fù)和相對真菌生物量均顯著高于TRV:00對照組（圖7e-h）。這些結(jié)果表明沉默GhVQ28基因會(huì)增強(qiáng)棉花對大麗輪枝菌的感病性。

圖7 下調(diào)GhVQ28削弱了棉花的黃萎病抗性

大麗輪枝菌是一種土傳真菌，經(jīng)過微菌核萌發(fā)，隨后菌絲增殖并侵入根皮層細(xì)胞間隙。接著菌絲定殖于木質(zhì)部導(dǎo)管，形成系統(tǒng)性侵染。該過程會(huì)激活茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）激素信號通路。GhMYB315轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控相關(guān)基因（如GhCAD、GhF3H等）調(diào)節(jié)苯丙烷類生物合成，同時(shí)促進(jìn)木質(zhì)素單體和黃酮類化合物的積累。GhMYB315調(diào)控的代謝重編程增強(qiáng)了棉花對黃萎病的抗性。

GhVQ28-GhMYB28模塊介導(dǎo)棉花大黃萎病抗性的模式圖

河南大學(xué)苗雨晨教授團(tuán)隊(duì)長期致力于植物環(huán)境適應(yīng)與改良和次生代謝調(diào)控方面的研究。近年來，在國際著名學(xué)術(shù)刊物《The Plant Cell》、《PNAS》、《Science Bulletin》等發(fā)表文章20余篇。

河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、棉花生物育種與綜合利用全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、作物逆境適應(yīng)與改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、河南大學(xué)三亞研究院苗雨晨教授為文章通訊作者。博士研究生郭玉濤、博士后錢艷敏為論文的共同第一作者。河南大學(xué)賈昆鵬教授、李坤副教授為本研究提供了重要指導(dǎo)，王驍博士為轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析提供幫助。澳大利亞昆士蘭大學(xué)Jimmy Botella教授對論文的修改提供了重要建議。該研究得到了國家自然科學(xué)基金國際合作與交流項(xiàng)目的資助。

參考文獻(xiàn)：

1. Billah, M., Li, F. & Yang, Z. (2021) Regulatory network of cotton genes in response to salt, drought and wilt diseases (Verticillium and Fusarium): progress and perspective. Frontiers in Plant Science, 12, 759245.

2. Cheng, H.-Q., Han, L.-B., Yang, C.-L., Wu, X.-M., Zhong, N.-Q., Wu, J.-H., Wang, F.-X., Wang, H.-Y. and Xia, G.-X. (2016) The cotton MYB108 forms a positive feedback regulation loop with CML11 and participates in the defense response against Verticillium dahliae infection. Journal of Experimental Botany, 67, 1935-1950.

3. Chen, J.Y., Xiao, H.L., Gui, Y.J., Zhang, D.D., Li, L., Bao, Y.M. et al. (2016) Characterization of the exoproteome involves in pathogenicity from cotton-containing medium. Frontiers in Microbiology, 7, 1709.

4. Chezem, W.R., Memon, A., Li, F.-S., Weng, J.-K. and Clay, N.K. (2017) SG2-type R2R3-MYB transcription factor MYB15 controls defense-induced lignification and basal immunity in Arabidopsis. The Plant Cell, 29, 1907-1926.

5. Liu, T., Chen, T., Kan, J., Yao, Y., Guo, D., Yang, Y., Ling, X., Wang, J. and Zhang, B. (2021) The GhMYB36 transcription factor confers resistance to biotic and abiotic stress by enhancing PR1 gene expression in plants. Plant Biotechnology Journal, 20, 722-735.

6. Mi, X., Li, W., Chen, C., Xu, H., Wang, G., Jin, X., Zhang, D. and Guo, W. (2024) GhMPK9‐GhRAF39_1‐GhWRKY40a regulates the GhERF1b‐and GhABF2‐mediated pathways to increase cotton disease resistance. Advanced Science, 11, e2404400.

7. Shaban, M., Miao, Y., Ullah, A., Khan, A.Q., Menghwar, H., Khan, A.H. et al. (2018) Physiological and molecular mechanism of defense in cotton against Verticillium dahliae. Plant Physiology and Biochemistry, 125, 193–204.

8. Yang, W.Q., Yao, D.D., Duan, H.Y., Zhang, J.L., Cai, Y.L., Lan, C., Zhao, B., Mei, Y., Zheng, Y., Yang, E.R., Lu, X.D., Zhang, X.H., Tang, J.H., Yu, K. and Zhang, X.B. (2023) VAMP726 from maize and confers pollen resistance to heat and UV radiation by influencing lignin content of sporopollenin. Plant Communications, 4, 100682.

9. Xue, J.S., Zhang, B.C., Zhan, H.D., Lv, Y.L., Jia, X.L., Wang, T.H., Yang, N.Y., Lou, Y.X., Zhang, Z.B., Hu, W.J., Gui, J.S., Cao, J.G., Xu, P., Zhou, Y.H., Hu, J.F., Li, L.G. and Yang, Z.N. (2020) Phenylpropanoid derivatives are essential components of sporopollenin invascular plants. Molecular Plant, 13, 1644-1653.

10. Zhang, Y., Wu, L., Wang, X., Chen, B., Zhao, J., Cui, J., Li, Z., Yang, J., Wu, L., Wu, J., Zhang, G. and Ma, Z. (2018) The cotton laccase gene GhLAC15 enhances Verticillium wilt resistance via an increase in defence‐induced lignification and lignin components in the cell walls of plants. Molecular Plant Pathology, 20, 309-322.

https://doi.org/10.1111/tpj.70562