中山大學(xué)李劍峰團(tuán)隊(duì)重構(gòu)擬南芥感知幾丁質(zhì)的受體復(fù)合物模型

幾丁質(zhì)（ chitin）是真菌細(xì)胞壁、昆蟲外骨骼以及線蟲卵殼與口器所共有的重要結(jié)構(gòu)多糖，其衍生的寡糖是植物免疫識別的關(guān)鍵分子模式信號，能夠激活植物廣譜的真菌抗性和抗蟲性。在模式植物擬南芥中，LysM受體激酶AtLYK5長期被認(rèn)為是幾丁質(zhì)的核心受體，與共受體AtCERK1組成受體復(fù)合物，由AtCERK1啟動胞內(nèi)的幾丁質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而，多項(xiàng)研究提示AtCERK1自身也能結(jié)合幾丁質(zhì)，由此引出一個(gè)尚未解決的關(guān)鍵科學(xué)問題：AtCERK1能否獨(dú)立介導(dǎo)對幾丁質(zhì)的免疫感知和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)？

近日，中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李劍峰教授團(tuán)隊(duì)在Science China Life Sciences在線發(fā)表了題為AtLYK4 is the major chitin receptor in Arabidopsis with N-glycosylation and ligand-interacting residues orchestrating chitin perception的研究論文，證實(shí)AtCERK1僅能獨(dú)立介導(dǎo)微弱的免疫反應(yīng)，而AtLYK4（而非AtLYK5）能夠與AtCERK1構(gòu)成具有完整功能的最小幾丁質(zhì)受體復(fù)合物。進(jìn)一步，揭示了AtLYK4胞外結(jié)構(gòu)域的N糖基化修飾以及幾丁質(zhì)結(jié)合口袋的兩個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)共同決定其幾丁質(zhì)結(jié)合能力，從而改寫并豐富了對擬南芥幾丁質(zhì)感知機(jī)制的認(rèn)知。

為重新梳理擬南芥的幾丁質(zhì)感知機(jī)制，該研究首先利用T-DNA突變體雜交和CRISPR技術(shù)構(gòu)建了缺失全部細(xì)胞膜LysM蛋白、對幾丁質(zhì)完全無感的八突變體（8m）。在8m基礎(chǔ)上，回補(bǔ)表達(dá)了AtCERK1（8m/C1），發(fā)現(xiàn)其能夠發(fā)生幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的二聚化和磷酸化，但僅能介導(dǎo)微弱的幾丁質(zhì)免疫反應(yīng)。進(jìn)一步，在8m中同時(shí)回補(bǔ)AtCERK1/AtLYK5（8m/C1/L5）或AtCERK1/AtLYK4（8m/C1/L4），發(fā)現(xiàn)僅后者能夠完全恢復(fù)野生型水平的幾丁質(zhì)免疫反應(yīng)。對于這一意外發(fā)現(xiàn)，研究者通過CRISPR技術(shù)重新構(gòu)建了缺失LysM蛋白的六突變體，僅分別保留AtCERK1/AtLYK4——6m (C1/L4)或AtCERK1/AtLYK5——6m (C1/L5)，證實(shí)了AtCERK1和AtLYK4能夠構(gòu)成具有完整功能的最小幾丁質(zhì)受體復(fù)合物。

圖1. AtCERK1和AtLYK4介導(dǎo)完整的幾丁質(zhì)免疫反應(yīng)

有趣的是，大腸桿菌表達(dá)純化的AtLYK4胞外域無法結(jié)合幾丁質(zhì)七糖（殼七糖），而擬南芥表達(dá)純化的AtLYK4則可以，提示其幾丁質(zhì)識別機(jī)制可能依賴真核特異的蛋白翻譯后修飾，如糖基化修飾。后續(xù)糖苷酶水解實(shí)驗(yàn)和N糖基化蛋白質(zhì)譜分析驗(yàn)證了這一猜想，發(fā)現(xiàn)AtLYK4胞外域存在6個(gè)N糖基化位點(diǎn)。突變這些位點(diǎn)（AtLYK4???）會顯著削弱其幾丁質(zhì)結(jié)合能力和突變體回補(bǔ)植株的幾丁質(zhì)免疫反應(yīng)，而AtLYK4???殘留的幾丁質(zhì)結(jié)合能力提示其同時(shí)存在不依賴于N糖基化的幾丁質(zhì)結(jié)合機(jī)制。通過同源建模和分子對接預(yù)測，AtLYK4胞外域存在一個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合口袋，其包含四個(gè)潛在的關(guān)鍵氨基酸殘基（Asp113、Asn134、Gly139和 Thr227）。點(diǎn)突變篩查發(fā)現(xiàn)，同時(shí)突變Gly139和Thr227在不影響AtLYK4糖基化的前提下，會使其完全喪失幾丁質(zhì)結(jié)合能力。上述結(jié)果表明，AtLYK4的幾丁質(zhì)結(jié)合口袋關(guān)鍵位點(diǎn)Gly139和Thr227以及N糖基化修飾共同決定其幾丁質(zhì)感知能力。重要的是，這些關(guān)鍵位點(diǎn)在番茄和本氏煙的同源蛋白中保守，提示該幾丁質(zhì)識別機(jī)制在植物中具有普適意義。

綜上所述，該研究通過精巧設(shè)計(jì)的分子遺傳實(shí)驗(yàn)重構(gòu)了擬南芥幾丁質(zhì)受體復(fù)合物，結(jié)合多層次的生化證據(jù)，確立了AtLYK4-AtCERK1為擬南芥幾丁質(zhì)感知的核心受體復(fù)合物，同時(shí)首次揭示N糖基化修飾在非LRR受體激酶的配體識別中起到關(guān)鍵作用，為理解植物免疫受體的功能演化和調(diào)控提供了新視角。需要說明的是，AtLYK4缺失突變體保留了部分幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的MAPK激活，提示在該信號支路上AtLYK5具有冗余的功能。

中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王鳳珠副教授為論文第一作者，李劍峰教授為通訊作者。博士生鮑穎、已畢業(yè)的碩士生姚欣然、已出站的博士后龔本強(qiáng)（現(xiàn)為廣西大學(xué)教授）、博士后熊翔宇、中山大學(xué)藥學(xué)院李哲副教授對該研究做出重要貢獻(xiàn)。該研究得到國家杰出青年科學(xué)基金和國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目資助。

論文鏈接：

https://www.sciengine.com/SCLS/doi/10.1007/s11427-025-3119-0