自身免疫病檢測新突破！ELISPOT 竟能揪出隱藏的記憶 B 細胞

摘要：在自身免疫病診斷中，血清自身抗體檢測是常用手段，但存在靈敏度不足的問題。記憶 B 細胞作為自身免疫反應的重要指標，其檢測能更精準反映病情。B 細胞酶聯免疫斑點試驗（ELISPOT）可在單細胞水平檢測血液中抗原特異性記憶 B 細胞，雖在感染性疾病和疫苗研究中廣泛應用，卻因自身耐受、免疫反應的組織特異性等因素，在自身免疫病檢測中面臨挑戰。本文將通俗解讀 ELISPOT 技術的原理、在自身免疫病中的應用、優缺點及發展前景，帶你了解這一檢測技術的奧秘。

一、自身免疫病診斷的 “老難題”：血清抗體檢測不夠用

在自身免疫病（ADs）的診斷中，血清自身抗體檢測是臨床的 “常規操作”。比如類風濕關節炎患者體內的類風濕因子、系統性紅斑狼瘡患者的抗雙鏈 DNA 抗體，這些抗體要么直接攻擊自身組織，要么作為疾病存在的 “信號兵”。但這種檢測方式有個明顯的短板：身體里大量的自身抗原可能會 “抓住” 循環中的特異性抗體，讓檢測變得不靈敏。

更關鍵的是，記憶 B 細胞（Bmem）可能是更靠譜的檢測指標。這類細胞是免疫系統的 “記憶庫”，一旦再次遇到相同抗原，就能快速分化成抗體分泌細胞（ASCs）。在抗病毒免疫中，記憶 B 細胞的檢測就展現出了更高的靈敏度，在自身免疫病中，它的活化循環還可能和病情發作相關，只是目前我們對這個過程的了解還不夠深入。而 B 細胞 ELISPOT 技術，就是捕捉這些記憶 B 細胞的 “利器”。

二、ELISPOT 技術：單細胞水平捕捉免疫細胞的 “信號” （一）ELISPOT 的基本原理

B 細胞 ELISPOT 技術最早在 1983 年被提出，如今已是量化抗體分泌細胞的有效工具。它的核心是在 96 孔板的聚偏氟乙烯（PVDF）膜上進行抗原包被，然后加入經刺激的外周血單個核細胞（PBMCs）—— 這些細胞里的記憶 B 細胞會被激活分化成抗體分泌細胞，分泌的抗體就會在膜上對應位置形成 “分泌足跡”，最后通過顯色反應，我們就能看到一個個代表單個抗體分泌細胞的斑點，實現單細胞水平的檢測。

（二）ELISPOT 的三種主要形式

如圖 2 所示，B 細胞 ELISPOT 主要有三種操作形式，區別在于抗原的包被方式：

直接包被：把抗原直接吸附在 PVDF 膜上，操作簡單直接；

親和包被：給重組抗原加上組氨酸標簽，通過抗組氨酸抗體將抗原固定在膜上，能更好保留抗原的天然結構；

反向 ELISPOT：先用泛 Ig 捕獲試劑捕捉所有抗體分泌細胞的分泌產物，再用帶標記的抗原去檢測特異性，適合篩查未知的抗原特異性。

（三）和 ELISA 的核心區別

很多人會把 ELISPOT 和 ELISA 弄混，其實兩者差別很大。ELISA只能檢測血清中已經存在的抗體總和，是對 “結果” 的檢測；而ELISPOT不僅能直接檢測體外的抗體分泌細胞，還能通過體外刺激，讓靜止的記憶 B 細胞分化成抗體分泌細胞后再檢測，相當于能找到免疫系統的 “潛在反應能力”，靈敏度也更高。

三、ELISPOT 在自身免疫病中的 “實戰應用”

ELISPOT 在感染性疾病和疫苗研究中早已成熟，如今也逐漸走進自身免疫病的研究領域，在多種疾病中展現出應用價值：

（一）類風濕關節炎（RA）

類風濕關節炎是典型的 B 細胞驅動型自身免疫病，患者體內的抗瓜氨酸蛋白抗體（ACPAs）是關鍵致病因子。研究人員用 ELISPOT 檢測患者的 PBMCs，發現經刺激后，能檢測到大量分泌 ACPAs 的抗體分泌細胞，還能觀察到這些細胞在骨髓和滑液中持續存在，甚至能穩定存活 6 個月以上，為病情監測提供了新依據。

（二）系統性紅斑狼瘡（SLE）

系統性紅斑狼瘡患者的病情容易反復，抗雙鏈 DNA 抗體是重要的疾病活動指標，但血清檢測并不總能精準反映病情。而抗雙鏈 DNA 的 B 細胞 ELISPOT 檢測，能更靈敏地反映疾病活動度，甚至可以預測病情發作。此外，ELISPOT 還發現，狼瘡患者體內的 CD27+IgD+ B 細胞產生 IgM 的能力下降，這也為研究疾病機制提供了線索。

（三）甲狀腺自身免疫病

在格雷夫斯病（GD）中，促甲狀腺激素受體抗體（TSHR-Ab）是致病關鍵，ELISPOT 可檢測針對 TSHR 的記憶 B 細胞，為判斷預后和治療效果提供參考；在橋本甲狀腺炎（HT）中，研究人員用 ELISPOT 監測靶向甲狀腺球蛋白的嵌合蛋白治療效果，發現該技術能有效評估 B 細胞的抑制情況。

（四）其他自身免疫病

在多發性硬化癥（MS）中，用人類腦裂解物作為抗原包被的 ELISPOT，能檢測到患者體內針對中樞神經系統的記憶 B 細胞，還能預測患者對格拉替雷等治療藥物的反應；在天皰瘡中，ELISPOT 可直接檢測到針對橋粒芯蛋白 3 的自身反應性 B 細胞，而這些細胞在健康人體內幾乎不存在。

表 2 總結了 ELISPOT 在不同自身免疫病中的應用形式，能清晰看到這項技術在各類疾病研究中的具體操作方式：

四、ELISPOT 的 “優缺點”：一把雙刃劍 （一）不可忽視的局限性

樣本要求高：需要活細胞，還可能涉及細胞的凍存和復蘇，相比血清檢測，樣本處理更復雜；

需體外刺激：記憶 B 細胞本身不分泌抗體，必須通過體外多克隆刺激讓其分化成抗體分泌細胞才能檢測；

抗原難題：自身反應性記憶 B 細胞可能主要存在于病變組織（如甲狀腺、胰腺），血液中含量極低，且很多自身抗原的重組蛋白尚未商業化，難以實現有效包被；

無法分離細胞：ELISPOT 只能量化細胞數量，不能物理分離細胞進行測序等進一步研究。

（二）獨具優勢的閃光點

單細胞分辨率：能精準定位單個抗原特異性抗體分泌細胞，檢測靈敏度遠超血清抗體檢測；

提前發現病情：可檢測到尚未分化為漿細胞的記憶 B 細胞，能更早發現免疫異常，為早期診斷爭取時間；

反映治療效果：在 B 細胞耗竭治療中，能監測記憶 B 細胞的變化，評估治療是否有效；

技術不斷升級：親和包被、反向檢測、自動化圖像分析等技術改進，讓 ELISPOT 的應用范圍越來越廣。

五、ELISPOT 的未來：不止于檢測

如今，ELISPOT 還和熒光檢測結合形成FluoroSpot技術，能同時檢測不同類型的免疫球蛋白，更深入分析免疫反應的特點；反向 ELISPOT 還能通過抗原滴定，了解自身反應性 B 細胞的親和力，為研究疾病進展提供更多細節。

更重要的是，ELISPOT 還能和單細胞測序等 “組學” 技術結合：先用 ELISPOT 找到含有自身反應性抗體分泌細胞的樣本，再對這些細胞進行單細胞 RNA 測序，就能深入挖掘自身免疫病的發病機制。未來，這項技術或許能成為自身免疫病診斷、病情監測和治療評估的 “常規武器”，為患者帶來更精準的診療方案。