東北師范大學陳莉教授ACS Nano：聚氨基酸抗真菌材料問世，10分鐘高效殺菌且不易耐藥

侵襲性真菌感染已成為日益嚴峻的全球公共衛生問題，每年報告的由真菌病原體引起的淺表性和致命性感染病例超過650萬例。然而，當前抗真菌藥物種類有限，且隨著耐藥真菌菌株的不斷出現，傳統藥物的療效逐漸下降。耐藥危機因傳統藥物的長期使用、生物利用度低以及單一作用機制而進一步加劇，凸顯了對能夠靶向真菌細胞膜完整性、細胞內結構和關鍵代謝途徑等多種生物學層面的創新抗真菌療法的迫切需求。

近期，東北師范大學陳莉教授、中國科學院長春應用化學研究所?肖春生研究員、Wan Pengqi博士合作合成了一種具有“噬菌體式”作用過程的胍基功能化聚氨基酸材料PArg??，它展現出卓越的抗真菌活性和良好的生物相容性。該材料模擬噬菌體的三步感染過程，通過“吸附-穿透-破壞”的級聯作用高效殺滅真菌。與臨床常用藥物相比，PArg??將根除真菌所需的時間從超過2小時縮短至僅10分鐘，并且在連續傳代15次后未顯示出明顯的耐藥性傾向。在小鼠角膜和全身性真菌感染模型中，PArg??能顯著降低真菌負荷和炎癥反應。相關論文以“Membrane-Targeting Poly(Amino Acids) with a Phage-Like Action Process for Antifungal Therapy”為題，發表在ACS Nano上。

示意圖1. (A) PArg??基于其通過抗真菌活性和選擇性指數篩選的最佳性能而被選中。(B) PArg??展現出包含三個連續步驟的噬菌體樣作用過程：吸附、穿透和破壞，從而有效破壞真菌細胞。(C) PArg??通過破壞膜穩態和觸發細胞內氧化應激反應誘導真菌細胞死亡。

研究團隊首先通過α-氨基酸N-羧酸酐的開環聚合，合成了一系列不同聚合度的富胍基聚氨基酸材料，并從中篩選出性能最優的PArg??。合成與表征數據（圖1）證實了材料的結構可控性與高純度。體外抗菌活性評估（圖1F-J）顯示，PArg??對多種白色念珠菌標準菌株具有高效抑制和殺滅作用，其抗菌活性呈現明顯的鏈長依賴性，且對哺乳動物細胞的毒性很低，選擇性指數優異。

圖1. PArg?的合成、表征及活性。 (A) 通過聚合、脫保護和胍基化合成PArg?的路線。(B) POrn??和PArg??的化學結構。(C) POrn??和PArg??的1H NMR譜圖。(D) POrn??和PArg??的13C NMR譜圖。(E) POrn??和PArg??的FT-IR譜圖。(F) PArg?對白色念珠菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC和MFC值。MIC和MFC值顯示為MIC/MFC (μg/mL)。(G,H) HC??及相應的選擇性指數(HC??/MIC)。(I,J) IC??及相應的選擇性指數(IC??/MIC)。

為了評估其長期有效性，研究進行了連續傳代誘導耐藥實驗（圖2A-B）。結果顯示，在連續15代暴露于PArg??后，白色念珠菌對其最小抑菌濃度未發生改變，而對照藥物氟康唑則出現了約16倍的耐藥性增長，表明PArg??不易誘導耐藥。此外，PArg??在極端pH、高溫或紫外線照射等苛刻條件下仍能保持穩定的抗真菌活性（圖2D-E），顯示出優異的理化穩定性。

圖2. PArg??的體外抗真菌性能。 (A) 用于誘導耐藥性的連續傳代實驗方案示意圖。(B) 白色念珠菌在連續暴露于FLZ (1/2 × MIC)、PArg?? (1/2 × MIC) 或兩者組合 (FLZ 1/8 × MIC + PArg?? 1/8 × MIC) 下的耐藥性發展。(C) 24小時內的生長抑制動力學。(D) 不同pH條件下PArg??的MIC和MFC值。(E) PArg??和FLZ經熱處理（100°C）和紫外線照射（254 nm）后的MIC變化。(F-I) PArg??和PArg?與臨床抗真菌藥物聯用時的FICI值。(J) 用不同濃度PArg??處理后，白色念珠菌表面Zeta電位的變化。(K) PArg??誘導的白色念珠菌細胞質膜去極化。(L) PArg??對白色念珠菌的靶向能力。比例尺代表10 μm。(M) 用不同濃度PArg??處理后，白色念珠菌活/死染色的流式細胞術分析。

PArg??與臨床抗真菌藥物聯用表現出協同效應（圖2F-I）。進一步的機理研究表明，PArg??通過靜電作用靶向并吸附于帶負電的真菌細胞膜表面（圖2J，L），引起膜電位去極化（圖2K），但并不立即導致細胞裂解。實時共聚焦成像（圖3A-C）清晰地展示了PArg??從膜吸附、穿透到進入細胞質的動態過程，隨后引發的細胞內紅色熒光（PI）增強表明細胞膜完整性逐漸喪失。掃描和透射電鏡觀察（圖3D-E）顯示，PArg??處理的細胞表面出現褶皺并覆蓋一層不均勻物質，細胞內結構發生紊亂。

圖3. PArg??與真菌細胞膜相互作用的機制。 (A) 顯示白色念珠菌被殺滅過程的延時共聚焦熒光圖像。比例尺代表5 μm。(B,C) 10秒和300秒時的熒光共定位分析；插圖中的白線表示線性共定位分析區域。(D) 用不同藥劑處理后白色念珠菌的SEM圖像和 (E) TEM圖像。比例尺分別代表5、2和0.5 μm。(F) 用不同濃度PArg??處理后，Annexin V-FITC/PI染色的流式細胞術結果。(G) 在不同PArg??濃度下，白色念珠菌細胞死亡模式的定量分析。(H) PArg??在高濃度和低濃度下的抗真菌機制示意圖。

細胞死亡模式分析（圖3F-H）揭示，低濃度PArg??主要誘導細胞發生類似凋亡的死亡，而高濃度則直接破壞膜完整性，導致類似壞死的死亡。深入研究其細胞內作用機制發現，PArg??會導致線粒體膜電位去極化（圖4A-D）和細胞內活性氧水平升高。同時，該材料還能穿透細胞并與真菌DNA結合（圖4E-G），計算模擬顯示其與DNA具有高結合親和力。

圖4. PArg??的細胞內作用機制。 (A) JC-1染色原理示意圖，用于檢測線粒體膜電位。(B) 共聚焦顯微鏡顯示PArg??處理后線粒體膜電位去極化（熒光從紅變綠）。比例尺代表10 μm。(C,D) 流式細胞術定量分析不同濃度和時間點下線粒體膜電位的變化。(E) 共聚焦圖像顯示PArg??-FITC（綠色）與Hoechst染色的DNA（藍色）共定位，表明PArg??與DNA結合。(F) PArg??與DNA分子對接模擬圖，顯示結合位點和相互作用。(G) 瓊脂糖凝膠電泳顯示PArg??引起DNA條帶阻滯。

轉錄組學分析（圖5）為理解PArg??的作用提供了分子層面的見解。差異表達基因富集分析表明，PArg??處理顯著影響了與細胞壁生物合成、幾丁質和氨基糖代謝以及膜錨定組分相關的基因表達，這與其破壞細胞膜和細胞壁穩態的機制相吻合。此外，PArg??還表現出強大的抗生物膜活性（圖6），不僅能抑制生物膜形成，還能滲透并清除已形成的成熟生物膜，這對于治療與生物膜相關的頑固性感染具有重要意義。

圖5. 抗真菌反應的分子通路。 (A) 白色念珠菌轉錄組測序示意圖。(B) 轉錄組數據的2D和 (C) 3D主成分分析。(D) 樣本間相關性熱圖。(E) 差異表達基因的火山圖。(F) 顯著富集GO術語的氣泡圖。

圖6. 體外抗生物膜性能。 (A) 生物膜形成和PArg??處理方案示意圖。(B,C) 結晶紫染色的宏觀和微觀圖像，顯示對生物膜形成的抑制和對成熟生物膜的清除。比例尺代表200 μm。(D) 生物膜形成抑制的量化。(E) 成熟生物膜根除的量化。(F) 經或未經PArg??-FITC處理的生物膜的3D共聚焦圖像。比例尺代表50 μm。(G) 用SYTO9/PI染色的生物膜的3D共聚焦圖像。比例尺代表100 μm。(H,I) 對照組和PArg??-FITC處理組生物膜中DAPI和FITC的共定位分析。(J) 熒光滲透到生物膜中的量化。(K) 經或未經PArg??處理的生物膜的活/死熒光比率分析。(L) PArg??處理后生物膜厚度的測量。(M) 不同處理后生物膜的SEM圖像。比例尺分別代表30和5 μm。

在體內實驗中，PArg??在小鼠真菌性角膜炎模型（圖7）和系統性感染模型（圖8）中均顯示出強大的治療功效。它能快速清除角膜和主要臟器中的真菌負荷，減輕組織損傷和炎癥反應，并顯著提高感染動物的存活率。重要的是，組織病理學檢查和血清生化指標分析證實了PArg??在體內具有良好的生物相容性和安全性。

圖7. PArg??在小鼠角膜炎感染模型中的功效。 (A) 角膜炎誘導和體內抗真菌評估示意圖。(B) 治療期間感染眼睛的代表性圖像及第5天的熒光素鈉染色。(C) 不同時間點的實時眼部熒光成像。(D) 第5天眼組織勻漿平板培養圖像。(E) 治療期間角膜炎的臨床評分。(F) 第5天熒光素染色角膜損傷面積的定量分析。(G) 不同時間點眼部熒光強度的定量分析。(H) 第5天角膜勻漿的CFU計數。(I) 角膜組織切片的H&E和PAS染色圖像。比例尺分別代表0.5 mm和50 μm。(J) 角膜組織切片中IL-1β和IL-6的免疫熒光染色圖像。比例尺代表50 μm。(K) 角膜厚度的定量分析。(L,M) IL-1β和IL-6的定量熒光分析。

圖8. PArg??在小鼠系統性感染模型中的功效。 (A) 系統性白色念珠菌感染建模和體內抗真菌評估示意圖。(B) 系統性感染小鼠的生存曲線分析。(C,D) 從感染小鼠收集的肝臟和腎臟組織的顯微鏡圖像。(E) 感染小鼠肝臟和腎臟組織的H&E染色切片。比例尺代表50 μm。(F-K) 各器官勻漿組織的菌落圖像和CFU計數。(L) 用于評估PArg??體內生物安全性的主要器官H&E染色切片。比例尺代表50 μm。

綜上所述，PArg??作為一種通過獨特“噬菌體式”過程發揮作用的新型抗真菌劑，展現出快速殺菌、不易耐藥、作用機制多重、穩定性高以及體內外安全性好等綜合優勢。該研究不僅提供了一種對抗耐藥真菌感染的有前景的新策略，其揭示的“吸附-穿透-破壞”作用范式也為未來設計多步驟、協同作用的抗微生物材料提供了新的思路。