Nat Methods |?徐濤/紀偉團隊開發出三維納米分辨率干涉定位顯微鏡ROSE-3D

在生命科學研究中，解析細胞內各種亞細胞結構以及蛋白質機器的納米尺度空間分布，是理解其生理功能和生命活動機制的關鍵。光學顯微鏡因具備高特異性和原位成像優勢，成為細胞生物學研究中的重要工具。

2014年獲得諾獎的單分子定位顯微鏡（Single-Molecule Localization Microscopy,SMLM），通過確定單個熒光分子的位置，成功實現了約20納米的分辨率，為生物學研究帶來了革命性的工具。然而，現有SMLM技術主要依賴對單分子圖像的中心位置進行擬合估計，定位精度高度依賴于圖像的形狀和光子數。當單分子處于焦面不同深度時，會因離焦使得單分子圖像遠大于點擴散函數，導致定位精度下降。同時，軸向（Z方向）方向的定位精度通常比橫向（XY方向）方向低2到3倍，導致三維成像的分辨率存在方向以及位置的差異性。這種各向異性分辨率限制了對三維亞細胞結構的精確解析。

為解決上述問題，徐濤/紀偉團隊在發展的干涉單分子定位顯微鏡ROSE（Nature Methods 2019）和ROSE-Z（Nature Methods 2021）基礎上（）， 在Nature Methods上發表了文章Molecular-scale Isotropic 3D Super-Resolution Microscopy via Interference Localization。 研究團隊成功開發的三維干涉單分子定位顯微鏡（ROSE-3D），首次在納米尺度上實現了基于相機和單物鏡的三維各向同性分辨率單分子定位顯微成像。干涉定位的基本原理是使激發光發生干涉，產生明暗變化的干涉條紋激發熒光分子，并基于不同條紋中的光子數進行定位，從而減少對單分子圖像形狀的依賴（如圖1）。

圖1.干涉定位原理

ROSE-3D通過設計基于光電偏轉器的高速照明切換光路，成功在X、Y、Z三個方向同時引入干涉光，并實現了小于1微秒的切換時間。基于該設計，ROSE-3D技術實現了基于相機的高通量單分子三維干涉定位（圖2a），并實現了分子尺度的三維各向同性分辨能力。該技術利用干涉定位原理，有效避免了對單分子圖像形狀的依賴，在超過一微米厚的單層景深范圍內，可將橫向定位精度提高2–6倍，軸向定位精度提升3.5–8倍（圖2b）。得益于其卓越的三維解析能力，ROSE-3D僅需層成像，即可對細胞內厚度約1微米范圍的微管蛋白中空結構實現納米級分辨率的清晰解析（圖2c-d）。

圖2.ROSE-3D的工作原理及對微管中空結構的解析

哺乳動物細胞核的核纖層主要由核纖層蛋白Lamin A/C和Lamin B組成，在維持細胞核結構與功能中起著關鍵作用。先前的研究表明，A/C型核纖層蛋白分布于B型核纖層蛋白內側【1】。然而，受限于傳統成像技術的各向異性分辨率，此前難以在三維角度上精確解析這兩種蛋白在納米級別的空間位置關系。借助ROSE-3D技術，研究團隊成功對厚度約4.3 μm的完整細胞核核纖層進行了成像，并清晰區分了AF647標記的Lamin A/C與CF660C標記的核Lamin B 1 。成像結果顯示，Lamin A/C定位于Lamin B 1 的內側,兩者之間的平均間距約為 10 nm（圖3a-b）。這一發現進一步驗證了早期研究，并凸顯了 ROSE-3D 技術在全細胞范圍內實現各向同性高分辨率成像的強大能力。

圖3.ROSE-3D對全細胞核纖層蛋白及DPR1復合物結構的解析

線粒體是細胞內負責能量產生、細胞凋亡和免疫反應等重要功能的關鍵細胞器，其形態通過持續的分裂與融合動態變化。線粒體分裂主要由動力蛋白相關蛋白1（dynamin-related protein 1，DRP1）介導。此前，冷凍電鏡研究已觀察到純化的DRP1蛋白在脂質管上組裝形成環狀或螺旋狀結構，由此推測它會在線粒體外膜周圍形成環狀或螺旋狀結構【2】。然而，冷凍電鏡缺乏特異性，而熒光顯微鏡受限于三維分辨率的各向異性，DRP1在線粒體分裂位點的原位組裝結構仍有待探索。本研究團隊利用ROSE-3D技術的各向同性分辨率優勢，對DRP1復合物進行了三維高清成像，成功解析出其環狀或螺旋狀的組裝結構（圖3d-e），并進一步開展了形狀、直徑及螺旋間距等形態學參數的分析。這也是首次在細胞原位實現對該蛋白復合體結構的納米級解析，充分展現了ROSE-3D在闡明蛋白質復合物原位結構方面的強大潛力。

綜上，ROSE-3D作為一項全新的三維多色納米分辨率成像技術，能夠以超高分辨率實現對亞細胞器結構以及生物大分子復合物的精準定位與組裝分析，為細胞原位三維納米結構的研究提供了強有力的技術支持。該技術突破了傳統光學超分辨成像分辨率各向異性的瓶頸，成功克服了成像方向和深度上的不均一性難題，首次實現了分子尺度的三維各向同性超分辨率成像。ROSE-3D在解析生物樣品內各種三維納米結構，以及揭示生物大分子的原位組裝機制等方面具有重要意義。目前，該技術已在懷柔科學城成功實現落地轉化，歡迎志同道合的人士加入，一起助力高端科學儀器國產化。

徐濤院士、紀偉研究員和谷陸生正高工是該論文的共同通訊作者，博士后羅世行、博士生趙先傲、副研究員李媛媛和副研究員樊春燕為共同第一作者。紀偉團隊研究生劉瑞娜、龔燃，正高工李尉興、副研究員馬娜娜及鄭州大學楊鄭鴻研究員為本研究做出重要貢獻。該工作得到中國科學院生物物理研究所生物成像中心高級工程師馮韻的協助。

https://www.nature.com/articles/s41592-025-02911-z

制版人： 十一

參考文獻

1. Nmezi, B., et al., Concentric organization of A-and B-type lamins predicts their distinct roles in the spatial organization and stability of the nuclear lamina.Proceedings of the National Academy of Sciences, 2019. 116(10): p. 4307-4315.

2. Kalia, R., et al., Structural basis of mitochondrial receptor binding and constriction by DRP1.Nature, 2018. 558(7710): p. 401-405.

學術合作組織

（*排名不分先后）

戰略合作伙伴

（*排名不分先后）

轉載須知

【非原創文章】本文著作權歸文章作者所有，歡迎個人轉發分享，未經作者的允許禁止轉載，作者擁有所有法定權利，違者必究。

BioArt

Med

Plants

人才招聘

近期直播推薦

點擊主頁推薦活動

關注更多最新活動！