圓因生物|基于反式剪接的PIET環化策略

2025 年 8 月下旬，圓因生物首款環狀 RNA 藥物 TI-0093 注射液的新藥臨床試驗（IND）申請獲 NMPA 批準，三個月后，TI-0093 在同濟大學附屬東方醫院順利完成 I 期臨床試驗首例受試者給藥。TI-0093 是一款基于環狀 RNA 的治療性腫瘤疫苗，采用 LNP 作為遞送系統，包封編碼經突變和免疫增強修飾的 HPV16 E7 和 E6 抗原的環狀 RNA，以肌肉注射作為給藥方式，臨床擬用于 HPV16 陽性的晚期復發或者轉移性實體瘤。TI-0093 IND 的注冊申報和 I 期臨床的啟動銜接如此緊密，說明圓因生物對于自主研發的環狀 RNA 藥物有著絕對的信心，以上市作為目的，并非僅僅是為了拿批件。圓因生物能如此迅速地將環狀 RNA 推進到臨床，跟其背后強悍的研發團隊是離不開關系的。

2025 年 8 月，圓因生物與基因編輯領域的大佬魏文勝實驗室（圓因生物科學創始人）共同在 Nature Communications 發表文章：Self-splicing RNA circularization facilitated by intact group Ⅰand Ⅱ introns，提出了兩種新型環化策略：基于反式剪接的 PIE 策略（PIET）與基于完整內含子的環化策略(CIRC)。同時，基于該研究成果的核心技術創新，團隊已提交專利申請（PCT/CN2024/094971）。近期，我們決定結合文章與專利，對圓因生物的環化技術做一個系列梳理，與大家共同交流學習。

第一期內容，我們將從基于反式剪接的 PIET環化策略開始。

在經典 PIE 環化策略中，線性前體 RNA 借助具有自剪接活性的Ⅰ型內含子完成環化反應。Ⅰ型內含子在 P6 處發生斷裂，一分為二為 5'Intron 切片與 3'Intron 切片，分別置于前體 RNA 的兩端。前體 RNA 從 5'→3'序列組成依次為：3'Intron 切片，外顯子 E2，編碼區 CDS，外顯子 E1, 5'Intron 切片。Ⅰ型內含子的自剪接反應由兩步酯交換反應構成。外顯子 E1 3'末端的一段序列與內含子 5'末端的一段序列形成堿基互補配對區域，稱為Helix P1。其中，屬于內含子 5'末端的序列稱為IGS 引導序列。外顯子 E1 最末端的核苷酸與 IGS 形成 u?G 錯配，核酶依靠 u?G 錯配精準識別 E1 的剪接位點（5'SS）。在第一次酯交換反應中，外源 GTP 的 3'-OH 會攻擊 5'SS，使得外顯子 E1 與 5' Intron 切片在 5'SS 處發生被切開，同時，GTP 被添加至 5'Intron 切片 5'端，而外顯子 E1 在 5'SS 切口處暴露出游離的 3'-OH。在第二次酯交換反應中，外顯子 E1 末端暴露的 3'-OH 作為親核基團攻擊 3'SS 剪接位點(外顯子E2 5'端)上的磷酸二酯鍵，使得 3'Intron 切片與外顯子 E2 在 3'SS 剪接位點處被切開，而外顯子 E1-3'端與外顯子 E2-5'端之間形成磷酸二酯鍵，從而使得 E1-E2 連接成環。

研究者產生了一個有趣的想法: 在 PIE 環化反應中，有沒有可能省去第一步酯交換反應，從一開始就進入到第二步酯交換反應呢？于是，他們獨立合成了兩條 RNA:1)第一步酯交換反應的中間產物，序列特征為 5'端包含 3' Intron 切片而 3'端缺乏 5'Intron 切片，擁有暴露 3'-OH 的外顯子 E1。2）5'端具有 G 的游離 5'Intron 切片。將獨立合成的兩條 RNA 混合，借助末端的同源臂，兩條 RNA 以反式作用組合為具備自剪接活性的核酶，完成第二部酯交換反應。令人驚訝的是，這種反式組合居然也可以正常合成 circRNA。研究者將這種反式 PIE 環化體系命名為 PIET。

可能我們會想，既然已經合成出第一步酯交換反應的中間產物（Intermediate），那是不是不需要 5'Intron 切片也能發生環化呢？答案是否定的。在 Intermediate 和 5'Intron 切片存在的情況下，沒有鎂離子起到催化作用，環化反應不會發生。其實，最不需要的就是游離 GTP，因為需要用到 GTP 的第一步酯交換反應已經被省去。總之，研究者發現反式 PIE 混合體系要完成環化反應需要的組分為：第一步酯交換反應的中間產物 RNA，5'Intron 切片 RNA，鎂離子。在文獻中，給出的反式 PIE 環化緩沖體系為：50mM HEPES（PH6.8），150mM NaCl，10mM MgCl2；給出的環化反應條件為 55℃，60min。

在 PIET反式剪接二元混合體系中，增加 5'Intron 切片 RNA 的摩爾比，能夠提升PIET環化效率。然而，即便將 5'Intron 切片 RNA 與中間產物前體 RNA 的摩爾比提升至 125，其環化效率明顯不如經典 PIE。

在專利中，研究者給出的 1×環化反應緩沖體系組分為：40mM Tris-HCl，6mM MgCl2，1mMDTT，2mM 亞精胺。在 1/5 ×環化反應體系總，使用 5 倍摩爾比的 5’ Intron 切片 RNA，延長反應時間，可顯著提升反式 PIET環化效率。

在專利中，研究者給出了 1820nt 中間產物 RNA 前體和 155nt 游離 5’ Intron 切片 RNA 的示例序列組成。從中可以看出，PIET 兩種 RNA 的序列設計是在經典 PIE-Ana 基礎上改造而來。使用 T7 啟動子轉錄合成 RNA 時，需要使用 G 作為轉錄產物的前幾個堿基,使用單個G可能會降低IVT產量。因此，研究人員分別在 5' Intron 切片 RNA-5'端設計 1 個 G 或者 2 個 G，有趣的是，1G 版本顯示出更好的環化效果。

小結

圓因生物設計的 PIET 反式剪接二元混合體系成功環化，使得我們對Ⅰ型內含子元件的組合排列對環化反應的影響有了更深入的認識，同時，說明經典 PIE-Ana 序列并非是死板不可改變的，通過靈活的元件設計，可以改造出更加新穎的環化體系，從而規避經典 PIE-Ana 環化系統的專利限制。

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