JEV丨足細(xì)胞來源外泌體CKAP4：糖尿病腎病非侵入性診斷的潛在新靶點(diǎn)

糖尿病腎病（ DN ） 因其早期癥狀隱匿、進(jìn)展不可逆，一直是臨床診療的難點(diǎn)。傳統(tǒng)的腎臟損傷標(biāo)志物敏感性有限，且腎穿刺活檢作為 “ 金標(biāo)準(zhǔn) ” 具有侵入性，難以滿足早期篩查和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的需求。

近日 ， 中國藥科大學(xué)梁宏偉教授 、南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院袁楊剛教授 、南京大學(xué)曾科教授、南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院丁大法教授 、泰康仙林鼓樓醫(yī)院王揚(yáng)天教授 以及 江南大學(xué)第一附屬醫(yī)院儲(chǔ)臘萍教授 在Journal of Extracellular Vesicles發(fā)表研究，發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞來源細(xì)胞外囊泡（ Podocyte-derived Extracellular Vesicles, Pod-EVs ）中的CKAP4蛋白，可作為DN的非侵入性診斷標(biāo)志物，為腎臟疾病的早期診斷帶來新希望。

尿源細(xì)胞外囊泡（ uEVs ）攜帶腎臟細(xì)胞的生物信息，是 DN 無創(chuàng)診斷的理想研究對(duì)象，但高效捕獲與精準(zhǔn)鑒定是核心前提。 研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了 WGA 偶聯(lián)磁珠的 uEVs 捕獲技術(shù)平臺(tái)，該平臺(tái)可有效區(qū)分正常人群與 DN 患者的 uEVs 濃度差異，為后續(xù)標(biāo)志物篩選奠定堅(jiān)實(shí)技術(shù)基礎(chǔ) 。

研究團(tuán)隊(duì)采用多組學(xué)結(jié)合生物信息學(xué)及機(jī)器學(xué)習(xí)的策略，從 uEVs 中篩選 DN 診斷標(biāo)志物。首先對(duì) DN 患者與對(duì)照樣本的 uEVs 蛋白組進(jìn)行定量分析，進(jìn)一步通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（ WGCNA ）挖掘與 DN 表型相關(guān)的核心蛋白模塊，結(jié)合 Limma 分析及隨機(jī)森林算法，最終鎖定多個(gè)候選蛋白，其中 CKAP4 的特異性與敏感性最為突出。

質(zhì)譜分析顯示， DN 患者 uEVs 中 CKAP4 表達(dá)水平顯著高于對(duì)照樣本；單細(xì)胞測(cè)序進(jìn)一步明確， CKAP4 高表達(dá)主要定位于 DN 患者腎臟的足細(xì)胞，在近端小管、系膜細(xì)胞等其他腎臟細(xì)胞中表達(dá)較低，提示 CKAP4 具有足細(xì)胞特異性。 Western blotting 與免疫染色結(jié)果一致： DN 患者尿 EVs 及腎臟切片中 CKAP4 表達(dá)顯著上調(diào)，且腎小球中 CKAP4 水平定量分析顯示其與 DN 病理損傷程度正相關(guān)；高糖（ HG ）處理足細(xì)胞（ HPC 細(xì)胞）后，細(xì)胞內(nèi)及分泌到 EVs 中的 CKAP4 表達(dá)均呈劑量依賴性增加，免疫熒光顯示 CKAP4 與 EVs 標(biāo)志物 CD63 共定位，流式細(xì)胞術(shù)也驗(yàn)證了 HG 處理后 HPC 細(xì)胞來源 EVs 的 CKAP4 熒光強(qiáng)度升高。

研究團(tuán)隊(duì)在 STZ 誘導(dǎo)的 DN 小鼠模型（ STZ-DN ）和 db / db 自發(fā) DN 小鼠模型中進(jìn)一步驗(yàn)證 CKAP4 的表達(dá)規(guī)律。兩種模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果高度一致：隨著建模時(shí)間延長（ 8 、 12 、 16 、 20 周），小鼠足突融合程度逐漸加重，腎小球病理損傷持續(xù)惡化，尿白蛋白 / 肌酐比值（ uACR ）不斷升高；同時(shí)，腎臟切片中 CKAP4 表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加， uEVs 中 CKAP4 水平也同步上調(diào)，且與足突寬度、腎小球損傷程度及 uACR 均呈正相關(guān)，明確 CKAP4 可反映 DN 進(jìn)展進(jìn)程。

研究團(tuán)隊(duì)通過大樣本臨床數(shù)據(jù)系統(tǒng)評(píng)估 uEVs 中 CKAP4 的 DN 診斷效能。流式細(xì)胞術(shù)顯示， DN 患者尿中 CKAP4 表達(dá)顯著高于健康對(duì)照（ HC ）、單純糖尿病（ DM ）及非糖尿病腎病（ NDRD ）患者； ROC 分析表明， CKAP4 區(qū)分 DN 與其他人群的曲線下面積（ AUC ）表現(xiàn)優(yōu)異，尤其在區(qū)分早期 DN （ I/II 期）與 DM 患者時(shí)仍有較高診斷價(jià)值 ， 且診斷效能優(yōu)于傳統(tǒng)指標(biāo)。此外， CKAP4 表達(dá)水平隨 CKD 病理分級(jí)升高而遞增，與 24 小時(shí)蛋白尿、微量白蛋白尿呈正相關(guān)，與 eGFR 呈負(fù)相關(guān)，還可反映腎小球硬化（ GS ）及間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮（ IFTA ）程度。更重要的是，連續(xù)隨訪數(shù)據(jù)顯示， DN 患者復(fù)診時(shí) uEVs 中 CKAP4 水平變化與 uACR 、 eGFR 變化趨勢(shì)一致，可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)治療效果與疾病進(jìn)展。

除診斷價(jià)值外，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探索 CKAP4 在 DN 病理進(jìn)展中的作用。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞來源 EVs 可被血管平滑肌細(xì)胞（ VSMCs ）攝取；高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞 EVs （ HG-EVs ）處理 VSMCs 后，鈣化相關(guān)基因（ Runx2 、 MSX2 ）及 YAP 蛋白表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量增加，茜素紅染色顯示鈣結(jié)節(jié)形成增多；而 YAP 抑制劑（ Verteporfin ）可逆轉(zhuǎn)上述效應(yīng)。機(jī)制示意圖表明， HG-EVs 攜帶的 CKAP4 可能通過激活 YAP 信號(hào)通路，促進(jìn) VSMCs 鈣化，進(jìn)而加重 DN 腎臟血管損傷，揭示 CKAP4 不僅是診斷標(biāo)志物，還可能是 DN 進(jìn)展的潛在治療靶點(diǎn)。

梁宏偉教授 團(tuán)隊(duì)成功構(gòu)建 uEVs 高效捕獲平臺(tái)，篩選并驗(yàn)證 CKAP4 為 DN 無創(chuàng)診斷與進(jìn)展監(jiān)測(cè)的特異性標(biāo)志物，其診斷效能優(yōu)于傳統(tǒng)指標(biāo)；在 STZ-DN 和 db / db 兩種小鼠模型中證實(shí) CKAP4 表達(dá)隨 DN 進(jìn)展動(dòng)態(tài)升高；進(jìn)一步揭示足細(xì)胞 EVs 攜帶 CKAP4 通過激活 YAP 信號(hào)通路促進(jìn) VSMCs 鈣化的病理機(jī)制。該研究為 DN 的無創(chuàng)診療提供了全新的生物標(biāo)志物與技術(shù)手段，具有重要的臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值。

原文鏈接：https://isevjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jev2.70208

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