【合成必備知識】LCMS基礎(chǔ)

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LCMS是常用的監(jiān)測手段，下面對其一些基礎(chǔ)知識進行介紹，內(nèi)容整理自網(wǎng)絡，版權(quán)歸原作者所有。質(zhì)譜分析是先將物質(zhì)離子化，按離子的質(zhì)荷比分離，然后測量各種離子譜峰的強度而實現(xiàn)分析目的的一種分析方法。

質(zhì)譜分析原理

分子在真空中被電子轟擊，形成離子，通過電磁場按不同m/e分離；質(zhì)譜圖的表示方法：以棒圖形式表示離子的相對峰度隨m/e的變化；提供的信息：分子離子及碎片離子的質(zhì)量數(shù)及其相對峰度，提供分子量，元素組成及結(jié)構(gòu)的信息，可以用于測定相對分子質(zhì)量、化合物分子式及結(jié)構(gòu)式。質(zhì)譜樣品：適合分析相對分子質(zhì)量為50~2000的液體、固體有機化合物樣品，試樣應盡可能為純凈的單一組分。

以下是FT-ICR質(zhì)譜儀工作過程：

離子產(chǎn)生

離子收集

離子傳輸

FT-ICR質(zhì)譜的分析器是一個具有均勻（超導）磁場的空腔，離子在垂直于磁場的圓形軌道上作回旋運動，回旋頻率僅與磁場強度和離子的質(zhì)荷比有關(guān)，因此可以分離不同質(zhì)荷比的離子，并得到質(zhì)荷比相關(guān)的圖譜。

離子回旋運動

傅立葉變換

相關(guān)概念

離子豐度（Abundance of ions）：檢測器檢測到離子信號強度。

相對離子豐度（Relative abundance of ions）：以質(zhì)譜圖中指定質(zhì)荷比范圍內(nèi)最強峰（基峰）的強度為100%。其它離子峰對其歸一化所得到的強度。標準質(zhì)譜圖均以離子相對豐度值為縱坐標。離子的豐度與物質(zhì)的含量相關(guān)，因此是質(zhì)譜定量的基礎(chǔ)。

EI：電子轟擊源質(zhì)譜，常用于GC-MS系統(tǒng)。

API：大氣壓電離源質(zhì)譜，常用于LC-MS系統(tǒng)。

MALDI：基質(zhì)輔助激光解吸電離源質(zhì)譜，常用于生物大分子分析。

HPLC：高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。

UPLC：超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）色譜理論認為提高色譜柱的效能（efficiency）就能增加儀器的解析度（resolution），而運用粒徑低于2μm的小顆粒無疑是增加效能的好方法。但減小固定相的粒度以增加色譜柱效能一直是色譜儀器科學的瓶頸，因為小顆粒不僅要求系統(tǒng)能承受高于目前極限壓力（比如6000psi/400bar），需要更小的系統(tǒng)體積（死體積），并且需要能適應可能只有幾秒峰寬的高速檢測器。

ESI：Electron Spray Ionization的縮寫，意思是電噴霧離子源，是質(zhì)譜儀中較為常用的一種離子化方式。電噴霧離子源屬于一種軟電離源,能使大質(zhì)量的有機分子生成帶多電荷的離子。

APCI：Atmospheric Pressure Chemical Ionization的縮寫，大氣壓化學電離源 APCI是20世紀90年代后使用的液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用的接口技術(shù)之一。溶液在氣流作用下形成氣溶膠，蒸發(fā)，電暈放電使溶劑電離，電子轉(zhuǎn)移或電子捕獲，使樣品帶電。

Mass Spectrum (MS) 相關(guān)知識

離子在電場中加速，在磁場中偏轉(zhuǎn)。正離子源適用于堿性化合物: 含氮化合物更容易粘附氫正離子，在正離子源中容易出分子離子峰。負離子源適合酸性化合物: 酸性化合物更容易轟擊掉氫正離子，如酸，酚類化合物。

一、加減分子量峰

常用的MS或者LCMS檢測為ESI電離源，當一種化合物不出MS或者MS異常的還可以作ACPI電離源檢測，可能會得到相應的結(jié)果。

加分子量峰: M+1(H+ ); M+23(加 Na+ ) ; 2M+23(兩分子共用一個鈉 離子)。

減分子量峰: M-56(脫叔丁基)和M-100(脫Boc),非常常見; M-16(脫NH3)和M-17(脫水)以及(M+2)/2(在電場里面粘附上2個正離子)， 含烯丙基或芐基的雜原子化合物，很容易出烯丙基或芐基的正離子碎片峰， 比較常見。

常見的離子片段

正模式

原因

M+1

[M+H]+

M+14

在LCMS中羧酸與甲醇成酯，或其他多一個碳的情況

M+18

[M+NH4]+

M+19

水合

M+23

[M+Na]+

M+33

[M+CH3OH+H]+

M+39

[M+K]+

M+42

[M+CH3CN+H]+

M+64

[M+CH3CN+Na]+

2M+1

二聚+氫離子，倍峰

2M+23

二聚+鈉離子

一系列相差42的峰

可能為石蠟油污染

一系列相差44的峰

可能為聚乙二醇污染

M-16

[M-NH2]+(多見于芐胺，烯丙胺，苯甲酰胺）

M-17

[M-OH]+(多見于芐醇，烯丙醇，苯甲酸）

M-31

[M-OCH3]+(多見于苯甲酸甲酯）

M-35

[M-Cl]+(多見于芐氯或烯丙基氯）

M-44

羧酸和含Cbz的分子常見，重排后脫CO2

M-45

[M-OCH2CH3]+(多見于苯甲酸乙酯）

M+1-56

含Boc的分子常見，脫叔丁基片段

M-79

[M-Br]+(多見于芐溴或烯丙基溴）

M+1-100

含Boc的分子常見，脫Boc片段

M-127

[M-I]+(多見于芐碘或烯丙基碘）

(M+2)/2

分子絡合兩個氫離子，半峰

負模式

原因

M-1

[M-H]-

M+X

[M+X]-, X=溶劑或緩沖溶液的陰離子

M+S-1

[M+S-H]-, S=溶劑

二、同位素峰

特別注意精確分子量和摩爾分子量的區(qū)別： 質(zhì)譜分子量都是用同位素質(zhì)量計算得到的。Chemdraw里精確分子量是高分辨的最高強度峰，是用組成該分子的所有原子在天然界中豐度最高的同位素的質(zhì)量加和得到的，對有多個同位素的原子，同一個分子碎片就有可能出現(xiàn)多個質(zhì)譜峰。比如下圖中的例子：氯原子有原子量為34.97和36.97兩個同位素, 而且天然豐度都是接近3;1, 其質(zhì)譜圖中就會出現(xiàn)155.05和157.05兩個分子離子峰, 且強度比接近3:1。自然界中的元素都是各個同位素的混合，因此摩爾分子量是按自然界中同位素的比例平均得到的。平時測MS時，可以直接通過 Chemdraw（手機APP--Kingdraw也挺好用）計算出質(zhì)譜的分子離子峰。

同位素峰的一個常見應用就是可以直接判斷所測的化合物是否含有Cl或Br等具有明顯同位素的原子。常見氯和溴同位素的表現(xiàn): 一個氯峰高比M+2/M=1/3; 一個溴為峰高比M+2/M=1/1), 同時含有多個同位素的表現(xiàn)可以用Chemdraw精確模擬。

另外一些特殊情況下可以通過同位素峰判斷是否反應完全，如下圖所示：A經(jīng)過偶聯(lián)生成B，利用LCMS監(jiān)測反應，如不仔細看同位素峰，就會誤判原料沒有反應。正模式下, 原料A[M+H]: 268, 270; 產(chǎn)物B只有[M+H]: 270。

HPLC相關(guān)注意事項

基本原理:實驗室常過的硅膠柱和TLC都是是正相柱，常見的HPLC是反相柱兩者在出峰時間上大體相反，即極性大的化合物先出峰，極性小的后出峰。但也不是所有情況都相反，例如有些在TLC板上極性小的化合物卻含有水溶性好的基團，出峰位置很可能會提前。

HPLC的應用: 測定反應液中各個組分含量，測定化合物純度，監(jiān)控反應是否完全。參照出峰時間和出峰面積來判斷原料轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物生成量。

流動相方法:0-60，5-95，10-80，30-90等等，可以讓分析人員設置: 。 0-60，5-95，10-80，30-90這些數(shù)字都是指乙腈的含量，乙腈含量越大，流動相極性越小，出峰越靠前，常用的是10-80的方法，根據(jù)10-80方法的出峰時間換用不同的方法。有機流動相也可以用甲醇，水相，正模式通常用0.05%的三氟乙酸水溶液， 負模式常用 0.02 % 或乙酸銨鹽水溶液。

特殊HPLC: 堿性柱和中性柱在酸性柱下不能分開的情況下使用 ELSD在紫外顯色弱或者沒有的情況，氣相柱適用于沸點低于300攝氏度的化合物。

使用注意: 峰高在1000-3000mAU之間，出峰時間在整個時間的1/4到3/4，峰寬小于0.5分鐘，顯示的純度是可信度比較大。

查看LCMS步驟:1)、先看MS部分，看有沒有所要離子峰，并且要看清楚峰是否有所需化合物MS信號，判斷該峰是否掩蓋周圍的峰。2)、再看HPLC部分，看含量有多少，并且要看清楚該化合物是否有強的HPLC信號，是否掩蓋周圍的峰; 3)、兩者結(jié)合起來看，判斷兩個峰是否對應，推測反應進行的程度和反應產(chǎn)生的雜質(zhì)。

注意事項：

1、LCMS的注意要點: LCMS是HPLC和MS的結(jié)合，HPLC和MS的出峰時間是有差異的，由于反應液是先通過HPLC分別走出各個峰，然后分別進入MS系統(tǒng)，因此MS的出峰時間比HPLC的出峰時間稍微滯后(具體滯后時間和具體機器有關(guān))，特別是反應液比較復雜的情況下一定要注意，不要將MS的峰對應了錯誤的HPLC峰，導致反應判斷錯誤。另外不能只靠LCMS檢測反應，特別是不點TLC，直接做LCMS。應該結(jié)合其他手段來確定化合物(特別是NMR).

2、正負離子源分別適合什么分子: 正離子源適用于堿性化合物，如含氮化合物更容易粘附氫正離子，在正離子源中容易出分子離子峰。負離子源適合酸性化合物，酸性化合物更容易被轟擊掉氫正離子，如酸，酚類化合物。所以要根據(jù)需要監(jiān)測的化合物的性質(zhì)來決定使用哪種離子源。

3、MS僅為輔助檢測手段，只可進行粗略判斷反應液中是否有該化合物，絕對不能從MS出峰強度來判斷反應液中樣品的含量。如果兩個結(jié)構(gòu)非常類似的化合物，HPLC出峰位置相同時，并且具有相同的官能團的話，可以通過MS出峰強度粗略判斷含量，可以考慮通過點板或HNMR確認比例。

4、0-60，5-95，10-80，30-90這些方法是指什么意思: 0-60，5-95，10-80，30-90這些數(shù)字都是指乙腈的含量，乙腈含量越大，流動相極性越小，出峰越靠前，常用的是10-80的方法，根據(jù)10-80方法的出峰時間換用不同的方法。

5、什么樣的HPLC譜圖具有可信度: 峰高在1000-3000之間，出峰時間在整個時間的1/4到3/4，峰寬小于0.5分鐘，顯示的純度是可信度比較大。

6. 其他注意事項：一、甲苯等在LCMS上有吸收峰的試劑作為溶劑的反應，在送LCMS監(jiān)測前一定要先除掉，不然會影響對反應的判斷，特別是溶劑峰剛好和產(chǎn)物或原料峰出在一個位置時。二、當點板和LCMS有很大出入時，LCMS要換其他方法重新監(jiān)測，切換正負模式或梯度，防止峰的重疊。三、一般監(jiān)測前，測樣要濾膜過濾，所以要確保所測樣品要完全溶解。

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