浪淘沙：西湖大學盧培龍/馬丹/陳子博等實現膜轉運蛋白的從頭設計，為靶向藥物遞送開辟新途徑

撰文丨王聰

編輯丨王多魚

排版丨水成文

跨生物膜的分子轉運對于生命活動至關重要，它使細胞能夠獲取營養、排出廢物、維持細胞穩態并與環境進行信息交互。盡管跨膜功能蛋白的從頭設計已取得一定進展，但如何構建能夠穩健、選擇性轉運特定小分子的人工跨膜轉運體系，仍是一項重大挑戰。

近日，西湖大學盧培龍、馬丹、陳子博等在“浪淘沙預印本平臺”發布了題為：De novo design of dual-topology membrane transporters 的研究論文。

該研究從頭設計了雙拓撲結構的膜轉運蛋白（dual-topology membrane transporter），這些設計蛋白能在活細胞和人工囊泡中介導小分子染料的選擇性攝取，其功能類似于天然單向轉運蛋白。冷凍電鏡結構分析顯示，其實際構象與設計模型高度吻合，功能實驗驗證了雙拓撲結構及其作用機制。

這項研究證實了以原子級精度從頭設計功能性動態膜轉運蛋白是可行的，為了解轉運蛋白的進化起源提供了新視角，并為靶向藥物遞送、代謝通路工程等應用開辟了新途徑。

膜轉運蛋白：生命的“守門人”

生物膜是細胞的屏障，控制著物質進出。膜轉運蛋白就像是細胞膜上的“智能門衛”，負責選擇性轉運離子、營養物質、藥物分子等，維持細胞穩態。如果設計出人工轉運蛋白，就能精準控制細胞對特定物質的吸收和排出，這在藥物遞送、代謝工程等領域具有巨大應用潛力。

然而，設計功能性膜轉運蛋白極具挑戰性。它需要精確的三維結構、特定的膜拓撲取向、底物識別能力，以及關鍵的構象動態變化——轉運蛋白需要在“內向”“閉塞”和“外向”等狀態間切換，像“呼吸”一樣實現物質轉運。

巧借對稱性：雙拓撲設計簡化動態機制

研究團隊創新性地采用了“雙拓撲”設計策略。天然轉運蛋白中，EmrE 等少數蛋白采用這種架構：單體以相反方向插入膜中，形成反平行二聚體。由于結構對稱，內向和外向構象的能量接近，只需設計一個對稱的、底物結合的“閉塞狀態”，就能利用熱力學驅動構象切換，實現被動轉運。

研究通過參數化方程生成具有 C2 對稱性的六螺旋束骨架，中央預留底物結合口袋。研究團隊選擇近對稱的染料分子 Cy3 作為模型底物，利用 Rosetta 和 ProteinMPNN 等設計工具優化蛋白-配體界面和序列。

設計中，在膜-水界面引入兩環兩親性芳香族殘基，平衡正電荷分布，確保蛋白能雙向插入生物膜中。計算篩選出 216 個設計蛋白，最終 50 個進入實驗驗證。

高效轉運：細胞和人工囊泡中驗證功能

在基于大腸桿菌的底物攝取實驗中，25 個設計蛋白顯示出強烈的 Cy3 染料積累，活性比對照組高出 13 倍以上。這些設計對 Cy3 表現出高度特異性，而對結構相似的 Cy3 DA 或其他染料如 Lucifer yellow 和 Calcein 則幾乎無轉運。

轉運活動呈時間和濃度依賴性，動力學參數與天然轉運蛋白相當。競爭實驗表明，Cy3 和 Lucifer yellow 共存時，設計蛋白選擇性轉運 Cy3，證實了路徑特異性。

點突變和化學修飾實驗進一步驗證了設計結合口袋的功能性。例如，將非極性氨基酸殘基突變為帶負電的氨基酸殘基會抑制轉運；在 Trans42_I7C 突變體中，MTSES 處理顯著抑制 Cy3 攝取，說明關鍵氨基酸殘基直接參與轉運。

結構精準：冷凍電鏡揭示原子級設計準確性

盡管轉運蛋白尺寸小，研究團隊通過融合剛性輔助域（例如 BRIL 或 MBP-DARPin）成功解析了 Trans25-sol 和 Trans42-TM 的冷凍電鏡結構，分辨率分別達 2.93 ? 和 3.40 ?。

結構顯示，跨膜域與設計模型高度一致，Cα RMSD 僅 1.2 ? 和 0.5 ?。中央空腔為底物結合位點，通道狹窄（半徑約 1.3 ?），需構象變化才能允許底物通過。分子對接表明 Cy3 能完美契合設計位置。

體外和拓撲驗證：功能廣泛適用

在無細胞的巨型單層囊泡（GUV）中，表達設計轉運蛋白的囊泡顯示 Cy3 熒光隨時間衰減，表明設計蛋白介導了底物外排。無功能的突變體則無此效應，MTSES 敏感性也與細胞實驗一致。

split-GFP 互補實驗證實了雙拓撲插入：當蛋白 N 端和 C 端同時融合 GFP 片段時，熒光強烈，說明兩端位于膜同側。單鏈版本仍保持轉運活性，支持了設計模型的合理性。

從設計到進化：啟示轉運的起源

許多天然轉運蛋白（例如 MFS 超家族）顯示內部三重跨膜（3-TM）倒置重復，提示它們可能由原始 3-TM 雙拓撲模塊通過基因復制融合演化而來。該研究設計的 3-TM 雙拓撲蛋白正好為這一假說提供了證據，展示了最小對稱單元如何實現定向轉運。

應用前景：定制化轉運蛋白時代

這項研究不僅證明了從頭設計動態膜蛋白的可行性，還開辟了廣泛應用：

• 靶向藥物遞送：設計特異性轉運抗癌藥物的蛋白，實現精準治療。

• 細胞工廠：在工程化代謝途徑中控制化學物質進出，提高產量。

• 基礎研究：作為模型系統研究膜蛋白折疊、動態和進化。

總的來說，該研究通過深度學習和計算設計，首次實現了功能完備的膜轉運蛋白的從頭設計。這些蛋白結構精準、動態智能、功能可靠，標志著蛋白質從頭設計領域邁入新紀元。

“浪淘沙預印本平臺”（LangTaoSha Preprint Server）于 2025 年 11 月正式上線，是由深圳醫學科學院（SMART）與深圳灣實驗室、清華大學、西湖大學以及其他頂尖高校和研究機構合作建立的一個由科學家主導的開放科學平臺。

該平臺旨在為生命科學領域的研究人員提供了一個高效、可靠且開放的學術交流環境。平臺支持研究成果在正式同行評議前的快速傳播，鼓勵實時討論，促進更廣泛的科學合作。此外，該平臺還引入了區塊鏈技術，為每一篇上線的論文生成獨一無二且不可更改的時間戳與加密憑證，以確保科學記錄的完整性和可追溯性。最終目標是構建一個更透明、高效且有影響力的全球科學生態系統。

論文鏈接：

https://langtaosha.org.cn/index.php/lts/en/preprint/view/74