Nat Biomed Eng | 戴倫治/趙毅合作利用瓜氨酸化修飾組學新技術結合AI解析類風濕關節炎自身抗原

瓜氨酸化（citrullination）是一種由瓜氨酸脫氨酶（PAD）催化的不可逆、低豐度蛋白質翻譯后修飾，質量偏移僅為+0.984Da。由于帶正電荷的精氨酸被中性瓜氨酸取代，這種變化可使蛋白質構象、電荷分布及功能狀態發生改變。類風濕關節炎（RA）是一種系統性自身免疫性疾病，以滑膜關節慢性炎癥和進行性骨破壞為主要病理特征，易導致關節畸形。大量研究表明，在RA發生發展過程中，瓜氨酸化蛋白/肽是驅動自身免疫應答的核心抗原之一，能夠誘發關節組織的免疫攻擊和持續性炎癥。因此，精準識別RA瓜氨酸化自身抗原對其精準診斷與機制研究具有重要意義。然而，蛋白質瓜氨酸化在體內豐度極低，其質量變化易與脫酰胺反應或13C同位素峰干擾信號混淆，并且結構變化極其細微導致缺乏特異性泛抗體富集瓜氨酸化肽段。傳統瓜氨酸化修飾組學通常是通過化學探針富集策略實現，該方法通常幾百微克蛋白以上，而且化學探針反應過程可能導致脫氨反應，造成假陽性。隨著生命科學和醫學研究向微量化、精細化方向發展，蛋白質修飾研究也亟需適合超微量體系的新技術。

2026年3月3日，四川大學華西醫院戴倫治和趙毅團隊合作在Nature Biomedical Engineering上發表題為“Low-inputdeep learning platform for citrullinated peptide identification, autoantigen discovery, and rheumatoid arthritis treatment stratification”的研究論文。該研究建立了基于內標輔助的納克級蛋白質瓜氨酸化修飾組學新技術。研究人員利用該技術解析了從正常人、RA風險個體到RA確診病人整個疾病演進過程中瓜氨酸化的動態變化規律，并建立了疾病活動度與瓜氨酸化的關系。結合瓜氨酸化肽段和臨床指標，該研究構建了針對甲氨蝶呤加來氟嘧啶（MTX+LEF）、甲氨蝶呤加羥氯喹（MTX+HCQ）兩種常用用藥方案的治療響應預測模型，為RA精準用藥提供了決策依據。此外，研究人員基于大規模ELISA數據訓練了融合自注意力機制的BiGRU模型預測瓜氨酸化肽段的RA血清反應活性，推動了RA自身抗原發現。

針對超微量樣品中瓜氨酸化修飾深度解析的挑戰，研究人員創新性地開發了一種無需親和富集、基于TMT標記內標輔助的納克級蛋白瓜氨酸化組學新技術（Iseq-Cit技術），被檢測的血漿樣品無需預先去除高豐度蛋白，且每個樣品的實際多肽上樣量僅為375納克。相較于該團隊于2025年5月26日發表的基于TMT標記的化學乙酰化內標的高通量乙酰化修飾檢測新技術Iseq-Kac（詳見BioArt報道：），Iseq-Cit技術采用PAD酶體外催化制備瓜氨酸化內標，彌補了部分修飾內標難以化學合成的局限，并且酶催化瓜氨酸化內標能更真實地模擬細胞內修飾狀態。Iseq-Cit技術通過使用瓜氨酸化內標，顯著增強了樣品中瓜氨酸化修飾多肽一級質譜信號，并有效觸發二級質譜碎裂，從而有效地提升了修飾肽段的檢測靈敏度，大幅降低了蛋白用量。研究人員進一步分離了人源抗環瓜氨酸化肽抗體（ACPAs）富集血漿樣品中的瓜氨酸化肽段，并通過靶向質譜分析對Iseq-Cit技術檢測到的部分瓜氨酸化肽段進行驗證，高達81.6%的瓜氨酸化肽段得到了靶向確認，而靶向分析中沒有鑒定到的瓜氨酸化肽段也并不意味著其不存在，可能與純化的人源ACPAs識別底物覆蓋度不足有關。

為了揭示RA演進過程中瓜氨酸化修飾的動態規律，研究人員利用高靈敏度的Iseq-Cit技術對711份人血漿樣本進行了高通量瓜氨酸化組學分析，涵蓋了357例RA患者、56名RA高風險個體及99名健康對照。其中，272例RA患者在首診后完成了一次隨訪和血樣提供，59例RA患者完成了2次隨訪和血樣提供。另外，RA高風險人群中有34例患者完成了5-7年隨訪。研究發現，在RA高風險個體中即存在瓜氨酸化異常，瓜氨酸化修飾主要富集于炎癥應答、補體激活和凋亡細胞清除等免疫相關通路，提示此階段已發生免疫激活。而在確診RA患者中，瓜氨酸化修飾顯著富集于核相關過程，如核小體組裝和染色質重塑，提示炎癥狀態下轉錄和翻譯活動增強。此外，研究人員還對8例人滑膜樣本進行了瓜氨酸化組學分析，發現RA患者滑膜組織中瓜氨酸化水平較OA患者高，且這些瓜氨酸化修飾主要富集于細胞外基質（ECM）蛋白、SLIT/ROBO信號通路和成骨抑制過程，提示RA滑膜中存在活躍的ECM降解和炎癥性結構重塑。

RA個體化治療方案的確立有助于減少無效治療和不良反應，降低致殘率。研究發現，在接受MTX+LEF或MTX+HCQ治療的RA患者中部分瓜氨酸化肽水平在治療反應良好組中顯著低于無效組，且其變化獨立于對應蛋白的表達，提示瓜氨酸化肽段可能作為療效預測指標。該研究進一步構建結合瓜氨酸化肽和臨床指標的治療反應預測模型，發現KNN分類器在獨立隊列中表現良好：MTX+LEF組的AUROC為88.3%，MTX+HCQ組為79.4%，顯著優于使用臨床指標、隨機肽段或者臨床指標加隨機肽段構建的預測模型，為RA精準用藥提供了新的決策依據。

鑒于ACPAs在RA關節損傷進展中的關鍵作用，識別新的瓜氨酸化表位對于完善RA早期診斷方法、理解發病機制及闡明ACPAs的產生與交叉反應機制至關重要。然而傳統依賴ELISA的RA血清反應的抗原肽篩選方式成本高、效率低。為此，該研究構建了一個深度學習模型預測瓜氨酸化肽的RA患者血清反應活性。研究人員收集了8,816條陽性肽和67,399條陰性肽，基于20種天然氨基酸和瓜氨酸的10項理化性質進行編碼，采用10折交叉驗證建立10個子模型，并對陽性樣本進行數據增強以平衡訓練集。在BiGRU、CNN、CRNN和Transformer等模型中，BiGRU表現最佳。利用BiGRU模型，研究人員預測了來源于病人血漿和滑膜組織中2,562條瓜氨酸化肽的RA血清反應活性，并隨機挑選了其中25條預測陽性肽和13條預測陰性肽在獨立隊列中進行ELISA驗證，ELISA結果顯示預測準確率高達84.2%。研究還發現這些瓜氨酸化肽段在RA患者血清中反應活性顯著高于其他疾病人群，顯示出良好的疾病特異性。

綜上所述，該研究開發了一種高靈敏度免富集微量蛋白質瓜氨酸化解析新技術系統繪制了RA進展各階段的瓜氨酸化圖譜，明確瓜氨酸化修飾與RA疾病活動度和治療響應的關系，證實了部分瓜氨酸化肽段具有早期診斷和預測藥物治療反應潛力，建立了深度學習模型準確預測瓜氨酸化肽段的RA血清反應活性。該研究為RA的診斷、精準用藥和發病機制研究提供了新思路，也拓展了AI技術在蛋白質修飾研究中的應用。

四川大學生物治療全國重點實驗室和華西醫院國家老年疾病臨床研究中心戴倫治研究員、四川大學華西醫院風濕免疫科趙毅教授為本文的共同通訊作者，四川大學生物治療全國重點實驗室胡夢博士、四川大學風濕免疫科華西醫院朱晨曦博士、孫蕊博士、龔艷秋博士和劉藝副教授、以及天府錦城實驗室許志強博士為本文的共同第一作者。感謝華西醫院實驗醫學科應斌武主任、瑞典卡羅琳斯卡醫學院Rikard Holmdahl教授等老師給予的課題指導。

https://www.nature.com/articles/s41551-026-01628-4

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