納米抗體+全人源庫：基于臨床支架和人類CDR的合成文庫設(shè)計

2025年5月，Specifica團隊在《MAbs》發(fā)表研究，報道了一種全新的VHH合成文庫設(shè)計方法。他們以四個臨床階段的治療性VHH為支架，引入經(jīng)序列風險清除的人類VH3家族CDR1/2，并搭配來自人類B細胞的天然CDR3，構(gòu)建了總轉(zhuǎn)化子達2.3×10^10的文庫。通過Protein A篩選確保正確折疊，并通過第二輪優(yōu)化（去除多酪氨酸+熱穩(wěn)定性篩選）進一步提升可開發(fā)性。針對IFNα2等靶點的篩選直接獲得了親和力在97 pM至15.6 nM之間的VHH，且V2版本中74%的分子可開發(fā)性優(yōu)秀。

研究流程：
選擇臨床VHH支架 → 人類VH3家族CDR1/2（清除風險）→ 酵母展示+Protein A過濾 → 人類B細胞CDR3 → 文庫組裝 → V2優(yōu)化（多酪氨酸去除+熱穩(wěn)定性篩選）→ 針對IFNα2等靶點篩選 → 可開發(fā)性系統(tǒng)評估

一、為什么是突破？——“一步到位”的范式轉(zhuǎn)變

傳統(tǒng)VHH開發(fā)需免疫駱駝、人源化、親和力成熟等多輪優(yōu)化，耗時且可能損害特性。本研究將已臨床驗證的VHH作為支架，直接引入人類來源、經(jīng)風險清除的CDR，并搭配天然人類CDR3，一步構(gòu)建出高多樣性、高“人性化”的文庫，篩選出的VHH無需進一步優(yōu)化即可具備藥物樣特性，實現(xiàn)了從“先發(fā)現(xiàn)后人源化”到“一步到位”的轉(zhuǎn)變。

二、如何設(shè)計的，實驗邏輯“四步法”

第一步：篩選優(yōu)質(zhì)支架。從9個臨床VHH中選出4個（卡普賽珠單抗等），要求能結(jié)合Protein A、無額外半胱氨酸、具有典型VHH框架特征。

第二步：CDR1/2來源與過濾。從40個人類供體的NGS數(shù)據(jù)中提取VH3家族CDR1/2，清除序列風險（如脫酰胺、異構(gòu)化、疏水斑等）。合成寡核苷酸池后，通過酵母展示和Protein A磁珠篩選，確保CDR不影響正確折疊。

第三步：CDR3來源與文庫組裝。從人類CD19? IgM? B細胞擴增CDR3，獲得>10?多樣性。將過濾后的CDR1/2與CDR3組裝，構(gòu)建噬菌體展示文庫。

第四步：V2改進。針對CDR3，用RNase H降解含連續(xù)酪氨酸的mRNA（去除多酪氨酸）；針對CDR1/2，進行76℃熱休克后Protein A篩選，富集耐熱序列。

三、關(guān)鍵數(shù)據(jù)：數(shù)字背后的“硬核”實力

• 文庫多樣性：V1文庫總轉(zhuǎn)化子2.3×101?，CDR3獨特序列1.6×10?。V2顯著降低了多酪氨酸序列（連續(xù)3個酪氨酸比例從~15%降至~5%）。

• 親和力范圍：針對IFNα2篩選，V1和V2分別獲得84和88個獨特序列，親和力在97 pM至15.6 nM之間，中位親和力分別為2.8 nM和2.0 nM（圖4c）。

• 可開發(fā)性提升：V2相比V1，在HPLC-SEC主峰純度、SMAC保留時間、多反應(yīng)性（PLE、心磷脂）等指標上顯著改善。V2中74%的VHH具有≤2個可開發(fā)性風險（V1為60%）（圖5l）。

• 普適性驗證：針對另外10個靶點，90%的靶點獲得至少一個<10 nM的VHH，50%獲得亞納摩爾級VHH（圖4f）。

  
  

V2文庫通過兩項改進顯著提升了可開發(fā)性：1）去除JH6基因編碼的多酪氨酸序列（已知與多反應(yīng)性相關(guān)），使CDR3的電荷分布更接近天然VHH；2）熱休克篩選富集耐熱CDR1/2，淘汰了熱不穩(wěn)定序列。數(shù)據(jù)顯示V2在多個可開發(fā)性指標上優(yōu)于V1，且親和力相當，驗證了“在設(shè)計階段引入可開發(fā)性過濾”的策略有效性。

值得注意的是，四個支架中有一個（基于sonelokimab的Lib3）在V2中表現(xiàn)稍差，提示不同支架對CDR的耐受性存在差異。若將表現(xiàn)最佳的支架組合（V2的Lib1/2/4 + V1的Lib3），可使77%的VHH達到優(yōu)秀可開發(fā)性標準，為后續(xù)文庫優(yōu)化提供了方向。

五、優(yōu)勢所在：從源頭設(shè)計“藥物樣”VHH

與現(xiàn)有VHH開發(fā)方法相比，本研究構(gòu)建的文庫平臺具有多維優(yōu)勢：

• 臨床支架保證框架可靠性：選擇已進入臨床的VHH（卡普賽珠單抗等），確保框架具有良好的表達、穩(wěn)定性和低免疫原性。

• 人類CDR1/2減少免疫原性：直接使用人類VH3家族CDR，避免了人源化步驟可能帶來的親和力損失。

• Protein A篩選保證正確折疊：利用Protein A結(jié)合依賴于正確構(gòu)象的特性，一步過濾掉錯誤折疊或突變的序列，同時確保純化便捷。

• 可開發(fā)性前移：在文庫構(gòu)建階段就清除序列風險（多酪氨酸、熱不穩(wěn)定），使篩選出的VHH天然具備良好可開發(fā)性，無需后期改造。

• 系統(tǒng)評估VHH本身：首次對大量VHH單體進行多維度可開發(fā)性評估（而非依賴Fc融合），更貼近實際治療應(yīng)用。

本研究建立了一種高效的、可直接輸出藥物樣VHH的文庫平臺，有望加速VHH藥物的發(fā)現(xiàn)進程。其意義在于：

• 方法論價值：為合成抗體文庫設(shè)計提供了新范式——將“可開發(fā)性”前置到文庫構(gòu)建階段，結(jié)合臨床支架和人類CDR，大幅降低后期優(yōu)化成本。

• 應(yīng)用前景：該文庫可直接用于篩選針對各類靶點（包括膜蛋白、可溶性蛋白）的VHH，尤其適合需要快速獲得高質(zhì)量候選分子的場景。未來可進一步：1）納入更多樣化的臨床支架；2）引入“駱駝化”突變以提升穩(wěn)定性；3）結(jié)合AI預(yù)測CDR與支架的兼容性；4）拓展至雙特異性或多特異性VHH構(gòu)建。

Erasmus MF, et al. Developing drug-like single-domain antibodies (VHH) from in vitro libraries. MAbs. 2025;17(1):2516676. doi: 10.1080/19420862.2025.2516676.

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