疫苗前沿 | 流感亞單位疫苗的研發進展：從病毒結構到臨床應用

摘要：流感病毒引發的疫情和大流行對人類健康構成持續威脅，開發安全有效的疫苗是應對這一挑戰的關鍵。本文系統梳理了甲型流感病毒的結構與生命周期，回顧了歷史上重大流感大流行事件，對比了不同類型流感疫苗的特點，并重點闡述了亞單位流感疫苗的研發進展。文中詳細介紹了基于核蛋白（NP）、基質蛋白 2 胞外域（M2e）和血凝素（HA）等蛋白的亞單位疫苗，分析了提高其 efficacy 的潛在策略，同時概述了當前處于臨床試驗階段及已獲批的流感疫苗。通過對現有研究的總結，本文旨在為理解流感亞單位疫苗的發展現狀和未來方向提供全面參考，強調了開發廣譜交叉保護的通用亞單位疫苗的重要性。

一、流感病毒概述：分類、結構與生命周期1.1 流感病毒的分類

流感病毒屬于正粘病毒科，根據國際病毒分類委員會的定義，該科包含五個屬：甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、托高土病毒屬和 Isavirus 屬。其中，甲型和乙型流感病毒含有血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）活性，而丙型流感病毒沒有 NA，但其具有血凝素 - 酯酶融合（HEF）蛋白。在這三類病毒中，僅甲型和乙型流感病毒能引發臨床疾病，乙型流感病毒通常僅導致局部暴發，而甲型流感病毒是引起人類大規模流行和大流行的主要病原體。

甲型流感病毒根據其表面糖蛋白 HA 和 NA 的抗原性進一步分為不同亞型，目前已發現 18 種 HA 亞型（H1-H18）和 11 種 NA 亞型（N1-N11），理論上可組合出 198 種亞型。不過，并非所有亞型都會感染人類，血清考古學數據顯示，H1、H2 和 H3 亞型曾在人類中有效傳播。值得關注的是，H5 亞型自 1997 年導致 6 名感染者死亡后，就被視為潛在的大流行病原體；2013 年出現的 H7N9 禽流感也引發了廣泛關注。高致病性的 H5 和 H7 亞型在 HA 切割位點存在多個堿性氨基酸的積累，這增強了病毒在宿主中的全身傳播能力，從而導致嚴重疾病。

1.2 甲型流感病毒的結構

甲型流感病毒的基因組由 8 個負鏈單鏈 RNA 片段組成，編碼 11 種病毒蛋白，這些蛋白在病毒復制和子代病毒包裝中發揮關鍵作用。主要的病毒蛋白包括結構蛋白 HA、NA、M1、M2 和 NP；三種 RNA 聚合酶，即聚合酶堿性蛋白 1（PB1）、PB2 和聚合酶酸性蛋白（PA）；以及三種非結構蛋白 NS1、NS2（核輸出蛋白，NEP）和 PB1-F2（圖 1）。

• HA（血凝素）：在病毒顆粒表面形成刺突，介導病毒與宿主細胞表面受體的結合，并通過膜融合幫助病毒進入細胞。

• NA（神經氨酸酶）：在病毒表面形成 knob 狀結構，催化子代病毒從感染細胞釋放，促進病毒傳播并感染新的宿主細胞。

• M1（基質蛋白）：在病毒組裝過程中參與 RNP（核糖核蛋白）的包裹。

• M2：一種跨膜蛋白，形成離子通道四聚體，具有 pH 誘導的質子轉運活性。在感染初期，M2 調節病毒核心的 pH；在感染后期，將病毒跨膜蛋白轉運到細胞表面。

• NP（核蛋白）：作為核心抗原，在病毒復制和轉錄中起重要作用。

• NS2：協助新合成的病毒 RNP 從細胞核輸出到細胞質，以便進行子代病毒顆粒的組裝。

圖 1：甲型流感病毒結構示意圖
病毒包含三種跨膜蛋白：HA、NA 和 M2 離子通道。基質蛋白 M1 在脂質雙層下方形成蛋白層。病毒包膜內是核糖核蛋白（RNP），由 RNA 片段與 NP 以及 PA、PB1 和 PB2 聚合酶蛋白結合組成。

1.3 甲型流感病毒的生命周期

甲型流感病毒的生命周期涉及主要病毒蛋白參與的多個關鍵步驟（圖 2）：

1. 感染與進入：病毒通過 HA 介導與宿主細胞表面的唾液酸結合，經受體介導的內吞作用進入細胞。

2. 膜融合與 RNP 釋放：具有蛋白水解活性的 HA 在酸性 pH 條件下發生構象變化，使病毒膜與內體膜融合；隨后，M2 質子通道使病毒核心酸化，導致 M1 外殼蛋白解離，病毒 RNP 釋放到細胞質中。

3. 核內復制與轉錄：NP 上的核定位信號促進 RNP 轉運到細胞核，在那里進行病毒 mRNA 轉錄和基因組復制。NS1 蛋白結合雙鏈 RNA 和宿主 mRNA 加工因子，抑制細胞干擾素誘導的抗病毒反應；聚合酶識別宿主 mRNA 的帽子結構，為病毒轉錄提供帶帽的 mRNA 引物。

4. RNP 輸出與組裝：在 NEP 的協助下，復制后的 RNP 從細胞核輸出，轉運到細胞膜與包膜蛋白（HA、NA、M1 和 M2）組裝。

5. 釋放：NA 通過去除唾液酸寡糖上的唾液酸，幫助新組裝的病毒顆粒從細胞表面釋放，并防止病毒顆粒自聚集。

圖 2：甲型流感病毒生命周期示意圖
以下五個步驟描述了感染性甲型流感病毒的生命周期：1）HA 蛋白結合含有唾液酸的靶細胞，隨后發生內吞作用并與內體融合，導致病毒膜與內體膜融合。2）病毒 RNP 釋放到細胞質中，然后轉運到細胞核。3）病毒基因組要么復制，要么轉錄為病毒 mRNA，然后轉運到細胞質進行病毒蛋白的翻譯。4）病毒 RNP 從細胞核輸出。5）成熟病毒在宿主細胞的細胞質膜上組裝并出芽，獲得病毒表面蛋白。

二、流感大流行歷史與疫苗研發的重要性2.1 20 世紀的三次重大流感大流行

• 1918 年西班牙流感（A/H1N1）：這是歷史上最嚴重的流感大流行，全球估計有 5000 萬人死亡。基因序列和系統發育分析表明，編碼 HA 和 NA 蛋白的基因來自一種在大流行前未在人類和豬中廣泛傳播的類禽流感病毒株。

• 1957-1958 年亞洲流感（A/H2N2）：由 HA、NA 和 PB1 三個新基因片段從類禽 H2N2 病毒引入，其余 5 個基因片段來自 1918 年衍生的 H1N1 譜系，導致超過 100 萬人死亡。

• 1968 年香港流感（A/H3N2）：HA 和 PB1 兩個新基因片段來自類禽 H3 和 PB1 物種，其余 6 個基因片段來自 1957 年的 H2N2 病毒，死亡人數約 70 萬。此次大流行相對溫和，可能與保留了 NA 蛋白有關。

• 2009 年甲型 H1N1 流感大流行：2009 年 4 月，一種新型豬源甲型 H1N1 病毒在墨西哥出現并迅速蔓延全球。截至 2009 年 9 月 13 日，世衛組織報告在 100 多個國家有超過 29.6 萬確診病例，至少 3400 人死亡。該病毒是北美禽 H3N2 病毒、H1N2 豬病毒和歐亞 H1N1 豬譜系病毒重組的結果，也是 1918 年大流行 H1N1 病毒的后代。

• 2013 年 H7N9 禽流感：2013 年 2-3 月，中國出現 3 例因新型禽源重組甲型 H7N9 病毒感染導致的嚴重下呼吸道疾病患者。截至 2014 年 6 月 27 日，世衛組織收到 450 例實驗室確診病例，其中 165 人死亡。盡管該病毒人際傳播能力較弱且未發現持續人際傳播，但仍需加強監測和疫苗研發等應對措施。

• 高致病性 H5N1 禽流感：H5N1 病毒于 1996 年首次從中國廣東的病鵝中分離出來，2003 年起在亞洲、歐洲和非洲的家禽和野鳥中傳播。1997 年香港首次確認 H5N1 病毒從禽傳給人，導致 18 人住院，6 人死亡。2003-2014 年期間，全球報告 667 例感染病例，393 人死亡，死亡率接近 60%。H5N1 病毒持續存在跨物種傳播并導致人類嚴重感染和高死亡率的威脅。

高致病性 H5N1 和其他新興或再出現的流感病毒持續存在大流行潛力，凸顯了開發有效疫苗和抗病毒藥物的重要性。盡管 NA 抑制劑和 M2 抑制劑等抗病毒藥物在一定程度上可用于控制大流行，但已出現多種耐藥病毒株。因此，疫苗接種目前被認為是應對流感大流行最有效的措施之一。

三、流感疫苗的類型與特點

目前開發的流感疫苗包括滅活病毒疫苗、減毒活病毒疫苗、DNA 疫苗、病毒載體疫苗、病毒樣顆粒（VLP）疫苗和亞單位疫苗。不同類型疫苗的優缺點及所用佐劑如下表所示：

表 1：不同類型流感疫苗的潛在優缺點

四、亞單位流感疫苗的研發進展

基于其快速、穩定、一致和可擴大的生產特點，重組亞單位疫苗已被證明是滿足潛在流感大流行需求的有效策略。與其他疫苗類型相比，亞單位疫苗由于不含感染性病毒，安全性最高。針對具有大流行潛力的流感病毒（如 H5N1 和 H7N9）的亞單位疫苗正在研發中，其中病毒結構蛋白（如 M2e、HA 和 NP）是有吸引力的疫苗靶點，M1 和 NA 等其他蛋白也具有開發潛力。

4.1 基于保守 M2e 蛋白的亞單位疫苗

流感病毒 M2 四聚體在感染細胞的質膜中高密度表達，其胞外域 M2e（N 端 24 個殘基）在甲型流感病毒中高度保守，其中 N 端表位 SLLTEVET（2-9 位殘基）在所有甲型流感病毒亞型中幾乎 100% 同源，因此 M2e 成為開發通用流感亞單位疫苗的理想靶點。

單個 M2e 分子的免疫原性較低，需要進行修飾以產生有效免疫反應。目前的改進策略包括：

• 構建含多個 M2e 分子的蛋白疫苗，如大腸桿菌表達的含不同 M2e 分子串聯拷貝的疫苗，在雞中對高致病性 A / 雞 / 廣東 / 04（H5N1）提供更好的保護。

• 將 M2e 與適當載體融合，如與多抗原肽（MAP）連接的 M2e 疫苗，在小鼠中誘導強烈的 M2e 特異性 IgG 抗體，保護其免受 PR8 A/H1N1、2009 年大流行 H1N1 或不同 H5N1 流感病毒的致死性攻擊。

• 將 M2e 與免疫原性蛋白成分融合，利用蛋白載體自身的佐劑活性，避免使用強佐劑或額外佐劑。例如，四個 M2e 分子串聯拷貝與流產布魯氏菌發光酶 synthase（BLS-4M2e）融合，在 Iscomatrix 或明礬佐劑存在下，小鼠存活率分別為 100% 和 80%，即使無佐劑，仍有 60% 的小鼠存活；H5N1 M2e 共有序列的三個串聯拷貝與激活相關蛋白 - 1（ASP-1）佐劑連接的重組融合蛋白（M2e3ASP-1），無需額外佐劑即可誘導顯著的 M2e 特異性免疫反應和對不同 H5N1 病毒的跨分支保護性免疫。

NP 在流感病毒中高度保守，作為內部蛋白能誘導針對不同甲型流感病毒的交叉保護性免疫，是開發通用流感疫苗的理想靶點。研究發現，NP 可誘導強烈的 CD4+ T 細胞反應（針對兩個保守表位 NP???????和 NP???????），還能誘導與保護相關的特異性 CD8+ T 細胞反應，已鑒定出至少 14 個人類 NP 肽作為細胞毒性 T 淋巴細胞（CTL）表位。

NP 加 Ribi 佐劑系統（RAS）與未加佐劑的 NP 相比，能增強體液和細胞免疫反應，表明基于 NP 的亞單位疫苗需要合適的佐劑。但 NP 誘導的免疫反應可能較弱，且無中和活性，無法誘導針對病毒感染的高效保護。

4.3 基于 HA 蛋白的亞單位疫苗

除高度保守的 M2e 和 NP 外，病毒表面的 HA 糖蛋白也是誘導針對流感病毒感染的保護性免疫反應的理想抗原。

• 全長 HA 蛋白：基于全長 HA 蛋白的亞單位疫苗在臨床前試驗和臨床試驗中顯示出誘導保護性免疫的能力。例如，桿狀病毒系統表達的針對高致病性經典 H5N1 流感病毒 HA 的重組蛋白（rH5HA），可保護小鼠免受致病性禽流感病毒的致死性攻擊，血清抗體持續 6 個月以上；基于 2009 年大流行 A/California/04/2009（H1N1）株重組 HA 的植物源亞單位流感疫苗 HAC1，在健康成人的 I 期臨床試驗中顯示出免疫原性和安全性。

• HA1 區域：HA1 區域（約 320 個氨基酸）比全長 HA 蛋白更具免疫原性，能誘導強效中和抗體并保護免受流感病毒感染。其 N 端較大片段形成膜遠端球狀結構域，包含受體結合位點和大多數病毒中和抗體識別的決定簇。研究表明，127 和 138 位殘基的糖基化掩蓋 HA 抗原雙突變體，可誘導強效中和抗體并對異源 H5N1 分支提供交叉保護；A/Anhui/1/2005（H5N1）的重組 HA1 蛋白與人類 IgG 的 Fc 和 foldon（Fd）三聚體基序（HA1-Fdc）融合，可誘導對 HA1 蛋白的強烈免疫反應，從而交叉中和不同的 H5N1 菌株；包含 H5N1 HA1 受體結合域（RBD）的關鍵中和域（CND，13-263 位殘基）與 Fc 和 Fd 融合（HA-13-263-Fdc），在最佳構象下誘導最強的中和抗體反應和對異源 H5N1 菌株攻擊的交叉保護。但由于序列變異，HA1 亞單位通常誘導株特異性中和抗體，針對不同組變異株誘導廣泛中和抗體的能力可能較低。

• HA2 亞單位：HA2 亞單位比 HA1 亞單位更保守，其誘導的免疫反應（尤其是莖區）有望引發針對不同流感病毒組的廣泛交叉保護性抗體，因此具有開發通用疫苗的潛力。研究顯示，基于合成 HA2 肽的亞單位流感疫苗免疫可保護小鼠免受 H1N1、H3N2 和 H5N1 流感病毒的攻擊；大腸桿菌表達的 HA2 蛋白可誘導免疫反應，保護小鼠免受 A/HK/68 小鼠適應株病毒的致死性攻擊。但與 HA1 亞單位相比，HA2 亞單位的免疫原性可能較低，無法誘導強烈的中和抗體。

• M1 蛋白：大腸桿菌表達的 M1 蛋白與殼聚糖佐劑配制，對同源 H9N2 攻擊的保護率達 100%，對異源 H1N1 和 H5N1 病毒攻擊的保護率分別為 70% 和 30%，表明 M1 蛋白可能誘導針對變異病毒株的廣譜免疫。

• NA 蛋白：雖然 NA 誘導的免疫對同源病毒有效，但通常認為其對不同流感病毒株的交叉反應性和交叉保護能力較弱。然而， recent 研究發現，針對 NA 保守表位（222-230 位殘基）的通用單克隆抗體能抑制所有甲型流感病毒亞型，并對小鼠提供針對 I 組和 II 組病毒攻擊的異亞型保護；NA 抑制抗體與雪貂對致死性 H5N1 攻擊的交叉保護相關，純化的異源 NA 蛋白加 Iscomatrix 佐劑也顯示出保護作用，這些研究強調了將 NA 蛋白納入疫苗成分的重要性。

與滅活和減毒活疫苗相比，亞單位疫苗誘導的免疫原性可能較弱，但可通過多種方法提高其免疫原性和 efficacy。

5.1 使用適當的佐劑

某些特定佐劑能顯著增強流感亞單位疫苗誘導的免疫反應和 / 或中和作用。例如，皂苷衍生佐劑 GPI-0100 可提高黏膜流感 HA 亞單位疫苗在免疫小鼠中的免疫原性和保護 efficacy；重組霍亂毒素 B 亞單位（rCTB）與重組桿狀病毒表面展示 HA（BacHA）經鼻內免疫小鼠，與未加佐劑的 BacHA 相比，顯著提高血清 IgG 和黏膜 IgA 免疫反應及血清中和抗體滴度；MF59 佐劑 trivalent 亞單位疫苗在嬰幼兒中誘導針對同源和異源流感病毒株的持續增強抗體反應，血凝抑制（HI）滴度顯著高于無佐劑疫苗。

5.2 融合多種病毒蛋白或與其他蛋白載體連接

融合多種流感病毒蛋白或將流感病毒蛋白與其他蛋白載體連接，也是提高亞單位流感疫苗免疫原性的有效方法，這在通用流感疫苗設計中較為常見。例如，TLR-5 配體鞭毛蛋白與四個保守 M2e 串聯拷貝融合的重組蛋白，可誘導強效 M2e 特異性抗體反應，保護免疫小鼠免受流感病毒致死性攻擊；流感 HA1 球狀頭部結構域與呼吸道合胞病毒 G 蛋白核心片段（Gcf）的融合蛋白免疫小鼠，分別誘導針對 HA1 和 Gcf 的增強血清 IgG 和黏膜 IgA 反應。

5.3 選擇合適的給藥途徑

合適的給藥途徑有助于增強宿主免疫反應。例如，舌下接種亞單位流感疫苗誘導的全身抗體滴度、黏膜中和 IgA 反應和流感特異性 Th17 細胞，與肌內接種相當。

5.4 結合不同的接種策略

結合不同的接種策略也可提高亞單位疫苗的 efficacy。例如，經鼻內初免 - 肌內加強策略，用含皂苷衍生 GPI-0100 佐劑的亞單位流感疫苗免疫小鼠，可獲得最佳的全身抗體和 T 細胞反應；NP 的 DNA 初免 - 蛋白加強是提高針對甲型流感病毒感染的交叉保護性免疫的實用方法。

六、處于臨床試驗階段和已獲批的流感疫苗

目前，多種預防甲型流感病毒感染的疫苗正在進行臨床試驗，部分已獲批用于人類（表 2）。

表 2：部分處于臨床試驗階段的流感疫苗及其階段

6.1 臨床試驗階段的疫苗

多種減毒活疫苗和滅活流感疫苗在健康成人、孕婦和兒童中進行了測試，顯示出誘導特異性抗體反應的免疫原性，不同人群的抗體持續時間不同。例如，AS03B 佐劑滅活 H5N1 疫苗在 6 個月至 17 歲兒童中具有免疫原性，抗體反應可持續長達一年；而 MF59 佐劑滅活 H7N9（A/Shanghai/2/13）流感疫苗在 19-64 歲成人中誘導 59% 的血清轉換率，但由于缺乏長期抗體反應或臨床結果，其潛在應用可能受限。

除減毒活疫苗和滅活疫苗外，病毒載體流感疫苗在臨床試驗中也顯示出對健康成人的免疫原性。例如，表達不同亞型 HA 和一種亞型 NP 的復制缺陷型腺病毒載體，在 18-28 歲青年中誘導高強度的體液和細胞免疫反應，并對 H5、H7 和 H9 流感病毒提供交叉保護；編碼甲型/California/7/2009（H1N1）病毒 HA2 與三聚化小鼠 CD40L 融合蛋白的重組腺病毒經鼻內給藥，增強特異性黏膜 IgA 和血清 IgG 抗體，誘導 HA2 特異性、CD40L 依賴的 T 細胞反應，并完全保護免受不同甲型流感病毒（包括 H1N1、H3N2 和 H9N2）的致死性攻擊，顯示出開發 HA2 基通用流感疫苗的可能性。

此外，越來越多處于臨床試驗階段的蛋白基亞單位疫苗顯示出良好的安全性、耐受性和 efficacy。例如，含 A/California/04/2009（H1N1）株 HA 的植物源重組蛋白 HAC1，能有效誘導免疫健康成人產生針對病毒感染的中和抗體反應；來自 A/Indonesia/05/2005（H5N1）的重組 HA 蛋白 HAI-05，在 18-49 歲健康成人中被證明是安全的，并誘導特異性抗 H5N1 免疫反應。

6.2 已獲批的疫苗

許多處于臨床試驗階段的流感疫苗已授權給制藥公司進一步開發，其中大多數是滅活疫苗和減毒活疫苗。例如，Aflunov 是一種 MF59 佐劑、雞蛋來源的 H5N1 流感疫苗，在嬰兒、兒童、青少年、成人和老年人中被證明是安全且耐受性良好的，對同源（A/Vietnam/1194/2004）和異源（A/Indonesia/05/2005 或 A/Turkey/15/2006）病毒株具有強烈的免疫原性，已授權給諾華疫苗和診斷公司。

在所有獲批的流感疫苗中，Flublok 是美國 FDA 批準的第一種重組疫苗，授權給 Protein Sciences Corporation（PSC）。這種昆蟲細胞表達的 HA 蛋白基疫苗可擴大生產規模，為快速開發針對大流行流感的亞單位疫苗提供了堅實基礎。

七、結論與展望

高致病性禽流感 H5N1、新出現的禽流感 H7N9 以及其他烈性甲型流感病毒帶來的持續大流行威脅，凸顯了開發安全有效的亞單位疫苗的迫切需求。與其他疫苗類型相比，基于流感病毒蛋白的亞單位疫苗具有最高的安全性。

未來，有望基于 M2e、NP 和 HA2 莖區的高度保守序列開發具有廣泛交叉保護作用的通用亞單位流感疫苗，越來越多的亞單位疫苗將進入臨床試驗并獲批用于人類。預計在亞單位疫苗設計和 efficacy 改進方面的新策略，將有助于減少未來流感大流行的威脅。

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撰寫| 藥時空

校稿| Gddra編審| Hide / Blue sea

編輯 設計| Alice