Nat Biotechnol. | 韓國(guó)科學(xué)家借助高通量篩選發(fā)現(xiàn)病毒元件可作為mRNA疫苗穩(wěn)定性增強(qiáng)劑

在mRNA技術(shù)迅猛發(fā)展的今天，一項(xiàng)來(lái)自韓國(guó)首爾國(guó)立大學(xué)的研究成果，正為疫苗和治療藥物注入新活力。2025年11月7號(hào)，《Nature Biotechnology》雜志在線發(fā)表了由金恩姬（V. Narry Kim）教授領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)論文，他們通過(guò)大規(guī)模病毒序列篩選，識(shí)別出11種新型RNA穩(wěn)定性增強(qiáng)劑。這些元素能顯著延長(zhǎng)mRNA在體內(nèi)的壽命，同時(shí)提升蛋白翻譯效率，尤其適用于堿基修飾的mRNA療法。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)有望解決mRNA疫苗穩(wěn)定性不足的痛點(diǎn)，推動(dòng)更耐用、低免疫原性的藥物開(kāi)發(fā)。

mRNA技術(shù)自新冠疫苗問(wèn)世以來(lái)，已革命性地改變了疫苗和治療領(lǐng)域。但其核心挑戰(zhàn)在于mRNA在體內(nèi)的穩(wěn)定性有限，一旦進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，mRNA易被快速降解，導(dǎo)致蛋白產(chǎn)生短暫且不充分。傳統(tǒng)線性mRNA通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成，帶有5'端帽和poly(A)尾巴，并常使用假尿苷（Ψ）、N1-甲基假尿苷（m1Ψ）等修飾堿基來(lái)降低雙鏈RNA副產(chǎn)物，減少免疫激活。然而，這些修飾雖能抑制免疫傳感器如蛋白激酶R和TRIM25，但無(wú)法有效對(duì)抗去腺苷化過(guò)程——這是mRNA降解的限速步驟，由CCR4-NOT復(fù)合物主導(dǎo)，導(dǎo)致poly(A)尾巴縮短，最終引發(fā)尿苷化和脫帽降解。現(xiàn)有替代方案如環(huán)狀RNA（circRNA）或自擴(kuò)增RNA（saRNA）雖更耐用，但面臨翻譯效率低、修飾不兼容或制造復(fù)雜等問(wèn)題，限制了臨床應(yīng)用。

為克服這些局限，研究團(tuán)隊(duì)從病毒中尋找靈感。病毒作為進(jìn)化高手，常利用宿主機(jī)制穩(wěn)定自身RNA。他們編譯了337種病毒物種、297個(gè)屬的基因組序列，總計(jì)196,277個(gè)197核苷酸的平鋪片段，構(gòu)建了一個(gè)覆蓋七大巴爾的摩分類(lèi)系統(tǒng)的病毒庫(kù)。這遠(yuǎn)超以往篩選的廣度和深度，包括雙鏈DNA病毒如皰疹病毒，以及單鏈RNA病毒如皮科納病毒。初篩階段，他們將這些片段插入增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP）的3'非翻譯區(qū)（UTR），整合到HEK293T細(xì)胞中，通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選（FACS）富集高表達(dá)細(xì)胞，獲得10,784個(gè)潛在增強(qiáng)劑。次篩則聚焦m1Ψ修飾mRNA，使用脂質(zhì)納米顆粒（LNP）遞送熒光素酶報(bào)告mRNA到HCT116細(xì)胞，比較轉(zhuǎn)染后0小時(shí)和36小時(shí)的RNA豐度，量化穩(wěn)定性提升。

篩選結(jié)果：131個(gè)片段顯著增強(qiáng)m1Ψ-mRNA穩(wěn)定性（調(diào)整P<0.001，對(duì)數(shù)2倍變>0.4），聚集成11個(gè)集群（A1至A11），源自不同病毒家族，如皰疹病毒科的HCMV（A1）、乙肝病毒科的HBV（A4）和皮科納病毒科的HAV（A6）。這些元素機(jī)制上通過(guò)招募末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶TENT4（TENT4A/B）延長(zhǎng)poly(A)尾巴，形成“混合尾巴”（主要腺苷偶摻非腺苷），有效抵抗CCR4-NOT的去腺苷化。其中，10個(gè)元素共享CNGG環(huán)狀結(jié)構(gòu)（如CNGGN五元環(huán)），A7則獨(dú)樹(shù)一幟，采用分支莖環(huán)結(jié)構(gòu)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示，所有元素在未修飾mRNA中均強(qiáng)勁提升熒光素酶表達(dá)，但僅A1、A2、A4、A6和A7在m1Ψ-mRNA中保留60%以上活性，證明其修飾兼容性。短版構(gòu)造（如A7S，155nt）往往更高效，暗示核心功能區(qū)精簡(jiǎn)。

特別值得一提的是A7元素，源自皮科納病毒科的Melegrivirus A。它在多種細(xì)胞類(lèi)型、遞送方式和編碼序列中均表現(xiàn)出色。通過(guò)深度誘變分析，團(tuán)隊(duì)揭示A7的結(jié)構(gòu)特征：一個(gè)帶凸起的莖（S1）連接內(nèi)部環(huán)（IL），分支出兩個(gè)小莖環(huán)（SL1和SL2）。關(guān)鍵基序包括IL中的“AGACCY”（Y為嘧啶）和SL2中的“GGGGNARUD”（R為嘌呤，D非C），這些區(qū)域?qū)Ψ€(wěn)定性至關(guān)重要。不同于其他元素依賴(lài)CNGG環(huán)招募TENT4共因子ZCCHC14，A7可能通過(guò)獨(dú)特機(jī)制實(shí)現(xiàn)尾巴延長(zhǎng)。在HCT116細(xì)胞中，A7-m1Ψ-mRNA的蛋白輸出比對(duì)照高出30倍以上，且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)5天以上，遠(yuǎn)超商業(yè)疫苗UTR如mRNA-1273和BNT162b2。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了A7的潛力。在小鼠肝臟模型中，A7線性mRNA的蛋白水平顯著高于環(huán)狀RNA，且表達(dá)持續(xù)超過(guò)2周，而環(huán)狀RNA雖穩(wěn)定但翻譯效率低。A7還兼容多種堿基修飾，降低免疫原性：它抑制了干擾素產(chǎn)生和炎癥細(xì)胞因子響應(yīng)，使mRNA更安全。研究顯示，A7在脂質(zhì)體或LNP遞送下均有效，且適用于不同編碼序列，如熒光素酶或綠色熒光蛋白。這使得線性mRNA平臺(tái)結(jié)合了高表達(dá)、耐用性和簡(jiǎn)單制造的優(yōu)勢(shì)，避免了環(huán)狀RNA的環(huán)化復(fù)雜性和saRNA的dsRNA免疫風(fēng)險(xiǎn)。

這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)為mRNA療法開(kāi)辟新路徑。傳統(tǒng)mRNA疫苗如新冠疫苗雖快速響應(yīng)，但療效短暫；如今，融入這些穩(wěn)定性增強(qiáng)劑的線性mRNA，可實(shí)現(xiàn)持久蛋白產(chǎn)生，適用于慢性病治療、基因編輯或癌癥免疫療法。團(tuán)隊(duì)強(qiáng)調(diào)，這些元素源自自然病毒，結(jié)構(gòu)緊湊，便于大規(guī)模生產(chǎn)，且無(wú)明顯毒性。未來(lái)，通過(guò)優(yōu)化組合或與CRISPR等技術(shù)整合，可進(jìn)一步提升療效。