Nat Biotechnol. | 韓國科學家借助高通量篩選發現病毒元件可作為mRNA疫苗穩定性增強劑

在mRNA技術迅猛發展的今天，一項來自韓國首爾國立大學的研究成果，正為疫苗和治療藥物注入新活力。2025年11月7號，《Nature Biotechnology》雜志在線發表了由金恩姬（V. Narry Kim）教授領導的團隊論文，他們通過大規模病毒序列篩選，識別出11種新型RNA穩定性增強劑。這些元素能顯著延長mRNA在體內的壽命，同時提升蛋白翻譯效率，尤其適用于堿基修飾的mRNA療法。這項發現有望解決mRNA疫苗穩定性不足的痛點，推動更耐用、低免疫原性的藥物開發。

mRNA技術自新冠疫苗問世以來，已革命性地改變了疫苗和治療領域。但其核心挑戰在于mRNA在體內的穩定性有限，一旦進入細胞質，mRNA易被快速降解，導致蛋白產生短暫且不充分。傳統線性mRNA通過體外轉錄合成，帶有5'端帽和poly(A)尾巴，并常使用假尿苷（Ψ）、N1-甲基假尿苷（m1Ψ）等修飾堿基來降低雙鏈RNA副產物，減少免疫激活。然而，這些修飾雖能抑制免疫傳感器如蛋白激酶R和TRIM25，但無法有效對抗去腺苷化過程——這是mRNA降解的限速步驟，由CCR4-NOT復合物主導，導致poly(A)尾巴縮短，最終引發尿苷化和脫帽降解。現有替代方案如環狀RNA（circRNA）或自擴增RNA（saRNA）雖更耐用，但面臨翻譯效率低、修飾不兼容或制造復雜等問題，限制了臨床應用。

為克服這些局限，研究團隊從病毒中尋找靈感。病毒作為進化高手，常利用宿主機制穩定自身RNA。他們編譯了337種病毒物種、297個屬的基因組序列，總計196,277個197核苷酸的平鋪片段，構建了一個覆蓋七大巴爾的摩分類系統的病毒庫。這遠超以往篩選的廣度和深度，包括雙鏈DNA病毒如皰疹病毒，以及單鏈RNA病毒如皮科納病毒。初篩階段，他們將這些片段插入增強綠色熒光蛋白（EGFP）的3'非翻譯區（UTR），整合到HEK293T細胞中，通過熒光激活細胞分選（FACS）富集高表達細胞，獲得10,784個潛在增強劑。次篩則聚焦m1Ψ修飾mRNA，使用脂質納米顆粒（LNP）遞送熒光素酶報告mRNA到HCT116細胞，比較轉染后0小時和36小時的RNA豐度，量化穩定性提升。

篩選結果：131個片段顯著增強m1Ψ-mRNA穩定性（調整P<0.001，對數2倍變>0.4），聚集成11個集群（A1至A11），源自不同病毒家族，如皰疹病毒科的HCMV（A1）、乙肝病毒科的HBV（A4）和皮科納病毒科的HAV（A6）。這些元素機制上通過招募末端核苷酸轉移酶TENT4（TENT4A/B）延長poly(A)尾巴，形成“混合尾巴”（主要腺苷偶摻非腺苷），有效抵抗CCR4-NOT的去腺苷化。其中，10個元素共享CNGG環狀結構（如CNGGN五元環），A7則獨樹一幟，采用分支莖環結構。驗證實驗顯示，所有元素在未修飾mRNA中均強勁提升熒光素酶表達，但僅A1、A2、A4、A6和A7在m1Ψ-mRNA中保留60%以上活性，證明其修飾兼容性。短版構造（如A7S，155nt）往往更高效，暗示核心功能區精簡。

特別值得一提的是A7元素，源自皮科納病毒科的Melegrivirus A。它在多種細胞類型、遞送方式和編碼序列中均表現出色。通過深度誘變分析，團隊揭示A7的結構特征：一個帶凸起的莖（S1）連接內部環（IL），分支出兩個小莖環（SL1和SL2）。關鍵基序包括IL中的“AGACCY”（Y為嘧啶）和SL2中的“GGGGNARUD”（R為嘌呤，D非C），這些區域對穩定性至關重要。不同于其他元素依賴CNGG環招募TENT4共因子ZCCHC14，A7可能通過獨特機制實現尾巴延長。在HCT116細胞中，A7-m1Ψ-mRNA的蛋白輸出比對照高出30倍以上，且持續時間長達5天以上，遠超商業疫苗UTR如mRNA-1273和BNT162b2。

體內實驗進一步驗證了A7的潛力。在小鼠肝臟模型中，A7線性mRNA的蛋白水平顯著高于環狀RNA，且表達持續超過2周，而環狀RNA雖穩定但翻譯效率低。A7還兼容多種堿基修飾，降低免疫原性：它抑制了干擾素產生和炎癥細胞因子響應，使mRNA更安全。研究顯示，A7在脂質體或LNP遞送下均有效，且適用于不同編碼序列，如熒光素酶或綠色熒光蛋白。這使得線性mRNA平臺結合了高表達、耐用性和簡單制造的優勢，避免了環狀RNA的環化復雜性和saRNA的dsRNA免疫風險。

這項發現為mRNA療法開辟新路徑。傳統mRNA疫苗如新冠疫苗雖快速響應，但療效短暫；如今，融入這些穩定性增強劑的線性mRNA，可實現持久蛋白產生，適用于慢性病治療、基因編輯或癌癥免疫療法。團隊強調，這些元素源自自然病毒，結構緊湊，便于大規模生產，且無明顯毒性。未來，通過優化組合或與CRISPR等技術整合，可進一步提升療效。