J VIROL|哈爾濱醫科大學趙文然/鐘照華教授團隊發現B組柯薩奇病毒3D聚合酶的擬素化修飾可促進病毒復制

B組 柯薩奇 病毒（ Coxsackievirus group B，CVB ）是一類無包膜的單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科腸道病毒屬。目前已知的CVB有六種血清型（CVB1~6），其引發的疾病譜系從普通感冒到病毒性心肌炎、胰腺炎及腦膜炎不等。其中，CVB1、CVB3和CVB5具有天然嗜心臟特性，而CVB3 已被證實是心肌炎、擴張型心肌病甚至心力衰竭的主要致病病原體 ，目前仍缺乏特異有效的抗病毒藥物。

近日，哈爾濱醫科大學趙文然教授聯合鐘照華教授團隊在Journal of Virology上發表了題為“The neddylation of the RNA-dependent RNA polymerase 3D of Coxsackievirus B3 promotes viral replication”的研究論文，系統的揭示了 擬素化（ neddylation ）修飾在促進CVB3復制過程中的關鍵作用和分子機制。

作者首先通過質譜分析技術對CVB3感染細胞的蛋白表達譜進行解析，發現病毒感染后NEDD8的表達顯著上調。隨后，為探究單個病毒蛋白是否具有影響擬素化修飾的能力，作者對表達病毒成熟蛋白或前體蛋白細胞中NEDD8的表達情況進行了檢測，結果顯示所有病毒蛋白均未能改變NEDD8表達水平，提示NEDD8上調及擬素化修飾增強是病毒復制所導致的。作者通過CVB5感染實驗證實，擬素化修飾上調現象在不同CVB血清型中具有普遍性，這暗示了擬素化修飾上調在CVB感染過程中具有重要意義。由于前期研究發現3D聚合酶存在泛素化修飾，而泛素與NEDD8蛋白具有高度同源性，作者因此推測3D可能發生擬素化修飾。為驗證該假設，作者進行了一系列實驗驗證，發現在發生翻譯后擬素化修飾的是3D而非3C或其前體蛋白。時間梯度實驗顯示，隨著病毒感染進程，高分子量的3D會發生持續性累積。此外，為了明確3D是否受NEDD8修飾，作者分別對過表達3D的細胞進行了變性免疫共沉淀實驗。結果顯示，外源表達的3D確實發生擬素化修飾。隨后，作者在病毒感染自然進程中也確認了3D的擬素化修飾現象。以上結果充分的證明了CVB3的3D蛋白發生擬素化修飾。

接下來，作者發現敲低NEDD8導致病毒RNA水平顯著下降，表明擬素化修飾能有效促進CVB3復制，點突變實驗進一步顯示3D的擬素化修飾特異性發生于第261位和第457位賴氨酸殘基。隨后，作者通過放線菌酮追蹤實驗檢測野生型3D及其K261、K457及K261/457位點突變體的降解速率，結果顯示過表達NEDD8可顯著抑制3D降解，這表明擬素化修飾能有效增強3D穩定性。相反，在K261、K457或雙位點突變體（K261/457）中，3D降解速率均顯著加快，這充分證明了擬素化修飾有助于提高3D的穩定性。

最后，作者對CVB3如何利用擬素化修飾來增強3D的穩定性進行了深入探究。作者通過免疫共沉淀實驗對與3D相互作用的蛋白進行檢測。由于 已知的NEDD8 E3連接酶均屬于泛素E3連接酶家族 ，因此作者特別關注泛素E3連接酶。有趣的是，質譜檢測的結果顯示TRIM4與3D蛋白存在相互作用。在后續實驗中，作者進一步證實了TRIM4不僅能與3D相互作用，還能以劑量依賴方式增強3D的擬素化修飾。此外，敲低TRIM4幾乎完全阻斷了3D的擬素化修飾，而過表達TRIM4有效的促進病毒蛋白3D和VP1蛋白的表達水平。更明顯的是，在過表達TRIM4的細胞中還觀察到CVB3的復制呈顯著提升。以上數據共同證明，TRIM4通過介導3D的擬素化修飾來促進CVB3復制。

綜上所述，本研究證實 NEDD8 在CVB3的3D蛋白的第261位和第457位賴氨酸殘基處發生修飾，有助于增強3D蛋白的穩定性，進而促進CVB3的復制。本研究的發現不僅揭示了CVB3致病機制中的新環節，同時表明靶向擬素化修飾過程可能成為抗CVB3感染的潛在治療策略。

原文DOI： 10.1128/jvi.01535-25

本期編輯：小黃