【前沿&進展】趙曉民/王志亮/翁長江團隊成功破解非洲豬瘟病毒（ASFV）致病機制的關鍵調控因子-g5Rp

近日，西北農林科技大學、中國動物衛生與流行病學中心及哈爾濱獸醫研究所聯合在病毒學國際知名期刊Journal of Virology上發表了題為“Role of g5Rp in African swine fever virus replication: disruption of host translation and autophagy”的研究論文，解析了g5Rp的蛋白晶體結構，闡明了ASFV進入宿主細胞后的快速復制的機制，并基于g5Rp晶體結構、分子對接及分子動態模擬，鑒定了g5Rp的天然小分子抑制劑9"-methyl salvianolate B，其可顯著抑制病毒復制，為抗ASF藥物研發奠定理論基礎。

非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus）引起的急性、高致病性和高致死率的傳染病，對全球養豬業造成重大經濟損失。在非洲豬瘟病毒（ASFV）復制早期，g5Rp蛋白扮演著“翻譯總控開關” 的關鍵角色。它像一個分子扳道工，能強行將宿主細胞的翻譯機器，從生產自身蛋白的軌道，切換到全力合成病毒蛋白的軌道上，即抑制宿主蛋白的合成，促進病毒蛋白的合成，從而實現病毒的快速增殖。

具體而言，g5Rp通過其Nudix水解酶活性降解宿主mRNA的5‘帽子結構，并破壞eIF5A-RPS15互作，從而雙重抑制宿主翻譯。這并非單純的關閉，而是通過解除宿主翻譯優勢，為病毒mRNAs（其翻譯不依賴于經典帽子結構）競爭核糖體資源創造了有利條件，實質上是將宿主翻譯系統重定向為病毒復制服務。

主要研究結果如下：

1.g5Rp促進ASFV的復制并調節宿主翻譯與自噬途徑

通過構建g5Rp過表達和siRNA干擾模型，實驗結果顯示，過表達g5Rp顯著提升了病毒滴度及病毒蛋白p30的表達水平，而干擾g5Rp則明顯抑制病毒復制，表明其具有促進病毒復制的功能。進一步通過蛋白質組學分析發現，g5Rp可調控宿主細胞內122種蛋白的表達，主要涉及翻譯調控、自噬、細胞凋亡等關鍵生物過程。GO和KEGG富集分析顯示，g5Rp顯著影響翻譯因子活性、溶酶體功能及自噬通路，提示其通過重塑宿主細胞環境，為病毒復制創造有利條件。

圖1. g5Rp促進ASFV復制并重塑宿主翻譯和自噬途徑

2.g5Rp與eIF5A和RPS15相互作用促進ASFV復制

Co-IP、PLA與過表達/敲低實驗證實，g5Rp同時結合eIF5A和RPS15，降低eIF5A總量及其hypusination修飾，削弱RPS15的核糖體定；eIF5A敲低或RPS15過表達均顯著升高病毒滴度和p30表達，而eIF5A過表達則抑制復制。結果揭示g5Rp通過雙重劫持宿主翻譯核心組分，打破eIF5A-RPS15功能復合體，從而優先保障病毒蛋白合成并促進ASFV復制。

圖2. g5Rp與eIF5A和RPS15相互作用，調節宿主翻譯以增強ASFV復制

3.g5Rp干擾eIF5A和RPS15之間的相互作用，抑制宿主翻譯

Co-IP 與鄰近連接實驗顯示，g5Rp可競爭性干擾eIF5A與RPS15之間的相互作用。嘌呤霉素摻入實驗發現，過表達g5Rp 以時間和劑量依賴性降低宿主翻譯，同時提高病毒蛋白的表達。eIF5A或RPS15單獨敲低證實了該表型，而eIF5A-RPS15融合蛋白則完全恢復翻譯水平。點突變證實g5Rp SER118/206與ASN61為關鍵競爭位點，突變后不再阻斷eIF5A-RPS15互作，翻譯抑制與促病毒效應降低，確證破壞這一復合體是g5Rp關閉宿主翻譯、助力ASFV復制的核心策略。

圖3. g5Rp破壞eIF5A-RPS 15相互作用并抑制宿主翻譯

4.g5Rp通過破壞eIF5A-TFEB軸而損害自噬

研究發現，g5Rp通過破壞eIF5A-TFEB軸顯著抑制宿主自噬。過表達g5Rp導致自噬底物p62積聚、LC3-II/I比值下降，提示自噬體-溶酶體通路受阻。機制上，g5Rp下調eIF5A總蛋白及其hypusination修飾，削弱其對TFEB翻譯的支持，從而阻斷TFEB核轉位；eIF5A抑制劑GC7或基因敲低均可模擬該自噬抑制表型。回補實驗顯示，恢復eIF5A水平可逆轉p62累積并重建自噬流。結果闡明g5Rp以eIF5A為支點，切斷TFEB介導的溶酶體生物發生，營造抑制性胞內環境，間接促進ASFV復制。

圖4. g5Rp通過下調eIF5A來降低細胞自噬

5.g5Rp與eIF5A或RPS15結合的關鍵相互作用位點

為精確定位g5Rp與eIF5A/RPS15的結合位點，作者首先解析g5Rp晶體結構，發現其以同源二聚體形式存在，表面形成連續疏水溝槽。分子對接與氫鍵網絡分析鎖定SER118、SER206及ASN61為關鍵氨基酸。將三位點同時突變為ALA后，g5Rp幾乎喪失與eIF5A/RPS15的互作能力。且g5Rp的突變體不在具備促病毒復制的能力。

6.9''-methyl salvianolate B結合ASFV g5Rp并調節eIF5A和RPS15相互作用

虛擬篩選與表面離子共振（SPR）鑒定出與g5Rp互作的天然化合物9''-methyl salvianolate B，可高親和力結合g5Rp，與LYS4、TYR174、LYS127、ASP169形成氫鍵/疏水網絡。在安全濃度（10 μM，CC50=16.22 μM）下，該化合物可抑制g5Rp與eIF5A/RPS15復合物形成并恢復內源性eIF5A-RPS15互作功能；提升eIF5A hypusination水平，恢復部分蛋白合成并緩解G0/G1阻滯；促進TFEB核轉位，提高LC3-II/LC3-I比值、降低p62水平，自噬功能得到恢復；同時，病毒基因轉錄（p72/p54/p30/g5Rp）與病毒滴度均顯著下降。本研究表明天然化合物9''-methyl salvianolate B通過靶向g5Rp并阻斷其與宿主因子eIF5A/RPS15的相互作用，有效恢復宿主翻譯與自噬功能，抑制非洲豬瘟病毒復制，為開發靶向病毒-宿主互作界面的抗ASFV藥物提供了具有潛力的先導化合物。

7.9''-methyl salvianolate B可恢復宿主功能并抑制ASFV的復制

9''-methyl salvianolate B以117 nM親和力占據g5Rp疏水口袋，阻斷其與eIF5A/RPS15的結合，恢復宿主翻譯和自噬。具體表現在，eIF5A hypusination水平恢復，提高宿主翻譯水平；增加TFEB的核移位水平，恢復細胞自噬。且9''-methyl salvianolate B可在一定程度抑制ASFV的復制。

綜上，該研究發現g5Rp其通過競爭性抑制eIF5A-RPS15互作，阻斷宿主蛋白質合成與自噬通路，進而促進ASFV復制，研究結果揭示了g5Rp促進ASFV復制的機制。同時解析了g5Rp的晶體結構，鑒定了與g5Rp互作的小分子候選物9''-methyl salvianolate B，為靶向病毒-宿主互作位點的抗ASFV藥物研發奠定了理論基礎。

g5Rp在ASFV復制中的機制示意圖

本研究的第一作者為西北農林科技大學許春梅博士，通訊作者為西北農林科技大學趙曉民教授、中國動物衛生與流行病學中心王志亮研究員、哈爾濱獸醫研究所翁長江研究員。