基于極端微生物代謝工程與合成生物學的“下一代生物制造技術”

原文發表于《科技導報》2025 年第23 期 《 基于極端微生物代謝工程與合成生物學的“下一代生物制造技術” 》

為實現“雙碳”目標，工業生物制造需向綠色可持續轉型。高耗水、高滅菌能耗及工藝不連續等瓶頸推動了以極端微生物為核心的下一代生物制造技術的發展?！犊萍紝蟆费埱迦A大學合成與系統生物學中心、生命科學學院、化工系、綠色生物制造全國重點實驗室陳國強教授等撰文，文章綜述了鹽單胞菌作為核心底盤的應用價值與技術進展，提出了未來需著力開發通用性更強的合成生物學工具，提升規?；l酵過程的穩定性，強化碳源預處理與工藝環節的整合度。

近年來，合成生物學的發展進一步推動了微生物生物制造在多樣化產品生產中的應用研究，并引領了下一代技術的探索。相較于常規微生物底盤，極端微生物憑借其在嚴苛環境中突出的生長能力，展現出顯著的抗染菌、可連續過程和低成本的生產潛力，尤其適用于大規模發酵生產各種生物產品（表1）?；跇O端微生物代謝工程與合成生物學改造的下一代生物制造技術，不僅有望顯著簡化工藝過程，支撐以低成本原料為底物、無需滅菌的開放式連續發酵，更進一步彰顯了其成為可持續制造領域核心綠色解決方案的潛力。

表1 極端微生物在嚴苛環境中突出的生長能力及其應用

01

極端微生物開啟生物制造新時代

1.1 生物制造代際躍遷的需求

利用微生物作為“細胞工廠”的生物制造技術，憑借其環境友好特性，正日益成為生產多樣化的化學品的重要替代方案，并受到廣泛關注。得益于合成生物學的快速發展，生物制造在生物燃料、生物材料、食品添加劑等多種化學品生產領域已展現出與傳統制造相當的競爭力，呈現出未來替代傳統石油基生產路徑的趨勢。

然而，以常規微生物及各類酵母為基礎的當前工業生物技術（CIB），其規?；瘧萌允芟抻趲讉€關鍵瓶頸：為防控雜菌污染所必需的高能耗滅菌過程、難以實現連續化生產導致效率低下，以及由此帶來的成本競爭力不足。

為突破這些限制，以極端微生物為底盤菌株的下一代生物制造（NGIB）應運而生。這一策略顯著降低了滅菌能耗、簡化了操作流程（尤其是淡水資源的消耗），并提高了生產的連續性。得益于針對此類極端微生物開發的遺傳操作工具箱，NGIB平臺已成功用于高效合成多種產品。

1.2 極端微生物的工業價值潛力

極端微生物指能夠在高鹽度、極端pH值、高溫或高壓等惡劣環境中生存的微生物，主要為原核細菌和古菌。根據其耐受的主要環境條件，它們被命名為嗜酸菌、嗜堿菌、嗜鹽菌、嗜熱菌和嗜旱菌等。部分菌株甚至具備多重環境耐受性（表1）。目前，極端微生物的應用主要集中于嗜熱菌（生長溫度>50℃）、嗜酸堿菌和嗜鹽菌這3大類群，呈現“三足鼎立”之勢。其中：

• 嗜熱菌因其高溫生長特性，在發酵過程中可顯著節省冷卻成本并有效防止雜菌污染。

• 嗜酸堿菌在極端pH值條件下生長具有天然的抗雜菌污染優勢。

• 嗜鹽菌的高鹽適應性使其在開放培養體系中大幅減少滅菌需求，有效降低生產成本，因此在可持續生物制造領域備受關注。

02

基于鹽單胞菌開發的“下一代工業生物技術”

鹽單胞菌Halomonas bluephagenesis TD01分離自新疆艾丁湖，是一株可天然合成生物聚酯PHB的嗜鹽菌。顯著優勢有：

• 耐受高鹽高堿環境，抗雜菌污染能力強；

• 其野生型菌株在優化的葡萄糖礦物質培養基中可高效積累PHB；

• 且細胞壁在低滲條件下易破裂，便于下游產物提取。

2.1 基因工程

在遺傳操作的核心工具方面，鹽單胞菌主要依賴3類載體系統：基于標準歐洲載體架構（SEVA）的pSEVA系列載體、經改造的pRE112?pMB1載體，以及基于天然毒素?抗毒素模塊構建的無抗生素表達系統pHbPBC。調控基因表達的關鍵在于啟動子工程，該菌株中已成功開發出多種啟動子工具。特別值得指出的是，強效的低氧誘導啟動子Pvgb及其工程化串聯版本P8vgb，顯著提升了該菌在微好氧條件下生產多種生物聚酯PHA的能力。核糖體結合位點（RBS）的優化則借助在線計算工具和RNA測序（RNA?seq）技術實現，而終止子工程則開發了高效的不依賴Rho因子的終止子。

基因組編輯技術的進步極大推動了代謝途徑的精準改造。在該菌中，編輯策略已從早期基于I?SceI內切酶介導的雙交換，發展至高效的CRISPR系統應用，基于小分子RNA（sRNA，如 PrrF1?2?HfqPa）的調控系統也能有效下調靶基因，顯著改變產物的組成。提升遺傳轉化效率是重要挑戰，利用大腸桿菌S17?1進行接合轉移是常用方法。

適應性進化是增強宿主性能的有效策略。盡管傳統蛋白質定向進化在鹽單胞菌中應用有限，近期開發的革命性正交轉錄突變系統（OTM）融合了噬菌體RNA聚合酶和脫氨酶功能，實現了超快速（1 天）、高效率（突變率提升150萬倍）的體內蛋白質進化，為未來代謝途徑的深度優化開辟了新途徑（表2）。

綜上所述，基于鹽單胞菌所開發的技術已發展出一套綜合體系，集成了精細的遺傳元件設計、多樣化的基因組編輯工具以及高效的宿主進化策略（圖1）。

表2 基于鹽單胞菌所開發的技術

圖1 基于鹽單胞菌所開發的技術

2.2 代謝工程

代謝流調控是極端微生物代謝工程的核心挑戰。因此，除了傳統的篩選、工程化與優化策略，還需要協同開發多種代謝工程方法，以強化目標產物的代謝通量，提升鹽單胞菌在生物制造中的產出。優化細胞形態是提高產物積累的有效策略。在鹽單胞菌中，通過基因工程擴大細胞體積已被證實能有效促進PHA的積累。此外，更為精細的調控策略也已開發，例如改造ClpXP蛋白降解系統，實現了對目標蛋白（如MreB）降解速率的動態、可調控降解，為精確控制細胞形態提供了新工具。

革蘭氏陰性菌的外膜結構在維持細胞完整性、降低通透性方面構成關鍵屏障。這些工程菌株表現出增強的細胞通透性，這不僅提高了異丙基?β?D?硫代半乳糖苷（IPTG）誘導的靈敏度，還增強了菌株在低氧條件下的適應性，增加了對抗生素的敏感性，改善了胞內氧氣攝取效率，并促進了相容性溶質四氫嘧啶的外泌。更重要的是，這些改造顯著提升了細胞干重、PHA含量以及PHA的轉化效率。最近，為降低PHA下游提取成本，在不同工程化的H. bluephagenesis菌株中應用了胞外多糖（EPS）缺陷策略，通過刪除特定的EPS合成基因片段（如PS1、PS2和PS4）。利用這些EPS敲除細胞進行發酵，有效減少了底物消耗，降低了能量需求，并顯著簡化了下游提取流程。

細胞內氧化還原環境的平衡是影響代謝物（尤其是PHA）高效積累的另一個決定性因素。為了在限氧條件下提升NADH/NAD+比值并促進PHA積累，可以靶向調節電子傳遞鏈。這一氧化還原工程策略使細胞干重中的PHB含量達到了90%，顯著超越了野生型菌株84%的PHA含量。利用外源添加乙酸來平衡NADH/NAD+比值也被證明是有效的策略。氧化還原平衡策略同樣適用于其他高附加值化學品的生產。

創新性調控系統的開發極大地推動了PHA生產的自動化和經濟性。通過對H. bluephagenesis TD菌株進行代謝工程改造，開發了一種基于PHA合成相關蛋白PhaR和PhaP1的自誘導表達系統。該策略構建了一個“自激勵”的生產系統，能夠在無需添加昂貴外源誘導劑（如IPTG）的條件下實現PHB的高效合成。深入研究表明，PhaR蛋白在這一過程中扮演著核心調控角色。這種精妙的自我調控機制顯著提高了PHA產量，并簡化了生產工藝，大幅降低了成本。為了進一步解決PHA生產中下游提取成本高昂的瓶頸問題，在鹽單胞菌中成功構建了一套智能自裂解系統。該系統首創性地使用PHA感應型的PhaP1啟動子進行調控，自動觸發裂解基因的表達。同時，通過優化裂解基因前的RBS，最大限度地減少其對宿主細胞PHA合成能力的干擾。這些突破性進展為PHA的工業化生產尤其是提純帶來了顯著的經濟效益。

綜上所述，通過對極端微生物鹽單胞菌進行多層次的工程改造，以及開發智能的自誘導和自裂解系統，這些工作成功開發出一系列具有顯著工業應用價值的下一代生物制造技術方案。這些系統性工程策略有效克服了PHA生產成本高昂的障礙，極大地推動了PHA生物可降解材料的商業化進程，充分展示了極端微生物代謝工程在可持續生物制造領域的廣闊應用前景。

03

基于鹽單胞菌的生物制造應用開發

3.1 鹽單胞菌生產PHA和小分子化合物

鹽單胞菌能夠高效合成2類關鍵產品：生物可降解材料PHA及多種高附加值化學品，為可持續工業生物技術提供了獨特平臺（圖2）。

在生物材料領域，PHA作為胞內積累的聚酯，因其優異的生物相容性、可降解性及材料可塑性，被視為石油基塑料的綠色替代品。鹽單胞菌天然具備PHA合成能力，通過代謝工程強化，整合外源phaAB基因可使PHB產量提升至細胞干重的76%。更重要的是，菌株改造已突破均聚物限制，成功生產含3?羥基丙酸（3HP）、4?羥基丁酸（4HB）、5?羥基戊酸（5HV）等單體的共聚物，顯著拓展材料性能譜。為降低生產成本，工程策略聚焦底物多元化：利用淀粉、木質纖維素水解物、餐廚廢料水解物等廉價碳源，并通過途徑重定向實現葡萄糖至PHA共聚物P(3HB?co?4HB)的直接合成。200-400立方米生物反應器規?；a驗證了其工業可行性。

圖2 用于生產多種生物制品的嗜鹽微生物細胞工廠的設計

高值化學品的生物合成是鹽單胞菌另一核心應用方向。氨基酸類產物中，四氫嘧啶作為高端化妝品與醫藥原料，在H. bluephagenesis中實現與PHB聯產。有機酸領域亮點突出：3?羥基丙酸（3HP）產量達154 g/L，衣康酸作為可再生平臺化學品通過全細胞催化實現高效轉化，甲羥戊酸（MVA）作為類異戊二烯前體產量達121 g/L。此外，γ?氨基丁酸（GABA）通過全細胞催化實現880 g/L超高產量，凸顯其生物催化潛力。

鹽單胞菌在蛋白質生產領域同樣展現獨特價值，其胞內積累的四氫嘧啶可穩定蛋白質構象，而天然分泌系統支持重組酶表達。此外，該菌屬作為嗜鹽酶資源庫，提供耐極端條件的水解酶與氧化還原酶，適用于制藥、食品工業。

創新應用方向正在拓展：PHA可酯化為生物燃料（如R?3?羥基丁酸甲酯），而H. bluephagenesis已實現丙烷、PHB與扁桃酸酯聯產。色素生產方面，工程化H. elongata的β?胡蘿卜素產量達560μg/g干重。

綜上所述，鹽單胞菌通過多層次代謝工程，已發展成為兼具“生物材料工廠”與“高值化學品合成平臺”雙重功能的超級微生物底盤（圖2）。其在開放連續發酵、底物廣譜利用及產品多元聯產方面的獨特優勢，為降低生物制造成本、推動循環經濟提供了關鍵技術支撐。

3.2 鹽單胞菌的廢棄物資源化利用

鹽單胞菌通常以葡萄糖為主要碳源，但部分菌株可天然利用非常規底物。然而，工業潛力突出的菌株因缺乏胞外酶分泌能力，難以利用復雜底物，需通過代謝工程改造解決。

針對淀粉利用，研究者改造H. bluephagenesis使其分泌淀粉酶和葡萄糖苷酶，成功以玉米淀粉為碳源合成PHA、PHB、PHBV、P34HB及四氫嘧啶等產物，搖瓶中細胞干重（CDW）達10 g/L，PHB含量占51%。木質纖維素水解產物木糖的利用亦獲突破：通過引入木糖轉運蛋白、異構酶及磷酸酮醇酶途徑，工程化H. bluephagenesis的PHB產量提升至5.37 g/L（CDW 8.81 g/L）。

餐廚垃圾的資源化利用是另一重點。工程化H. bluephagenesis在細胞外膜合成基因ompW啟動子驅動下過表達PHA操縱子，以富氮食物垃圾水解液為原料，在7?L生物反應器中CDW達70 g/L，PHB含量占80%。針對低成本底物乙酸，通過適應性實驗室進化獲得耐受性菌株H. bluephagenesis B71，進一步引入甲羥戊酸途徑并結合非氧化糖酵解設計，使MVA產量達121 g/L。

CO2固定技術為碳中和提供新思路。值得注意的是，部分鹽單胞菌（例如H. rowanensis）通過還原性三羧酸（rTCA）循環而非卡爾文循環實現化能自養，以硫代硫酸根為能源，其獨特CO2同化機制的闡明將對工業應用產生深遠影響。

04

“下一代生物制造技術”的產業實踐

NGIB作為當前工業生物技術的重大升級與創新方向，其核心優勢在于利用極端微生物（如鹽單胞菌）作為底盤細胞進行生物制造。這些微生物能在高鹽等極端環境下生長，從根本上消除了傳統發酵過程中復雜且高能耗的滅菌步驟需求，實現了開放發酵。這一特性賦予了NGIB顯著的優勢：高底物轉化率、低能耗、節水以及環境友好性（因其產生的廢水量少且可回收利用）。此外，通過工程技術（如增大細菌體積或調整表面電荷）誘導微生物發生自絮凝沉降，NGIB極大地簡化了產物的下游分離純化過程（圖3）。

圖3 基于鹽單胞菌的下一代工業生物技術流程

NGIB技術已成功應用于多種高價值產品的生產，特別是生物可降解材料PHA以及各類精細化學品。隨著合成生物學工具的快速發展及其在鹽單胞菌工程化中的應用，NGIB的優勢不斷被強化和完善，并已在中國實現工業化。其中，微構工場專注于工業發酵，尤其是在PHA生產和鹽單胞菌應用方面處于國際前沿，已成功建成全球首個萬噸級PHA生產線。為進一步擴大規模，微構工場與安琪酵母（Angel Yeast）合作建立合資企業，產品線涵蓋PHA顆粒、吸管、注塑餐具、淋膜紙杯、3D打印材料和醫藥中間體等多元化終端應用（圖4）。綜上所述，憑借其高效、節能、節水和環境友好的核心特點，NGIB正迅速發展成為工業生物技術領域至關重要的未來方向。

圖4 國內部分PHA企業發展歷程

05

結論

極端微生物特別是鹽單胞菌，正成為下一代生物制造的重要生產平臺。這類微生物具有獨特的環境適應能力，其強大的抗污染特性尤為突出，使得在開放環境下進行非滅菌發酵成為可能，顯著降低了生產能耗與成本。

未來突破需系統整合前沿技術、智能裝備與政策支持。技術層面亟需開發高效菌種篩選技術，構建跨物種基因表達載體，優化CRISPR等基因編輯工具的多位點編輯能力，建立從基因序列到生理功能的預測模型，設計耐受嚴酷環境的遺傳元件，并統一代謝分析標準。產業實施路徑應包含：建立代謝模型指導產物合成路線設計，拓展工農業廢棄物等替代原料的應用，采用智能生物反應器實現精準工藝調控。依托中國“雙碳”政策支持，通過發展循環經濟模式推進廢棄物資源化利用，構建完整產業生態鏈。隨著關鍵技術瓶頸的突破與產業生態的成熟，基于極端微生物的下一代生物制造技術將在全球綠色制造體系中發揮重要作用，為可持續發展提供關鍵技術支撐。

本文作者：陳江楠、陳國強

作者簡介：陳江楠，清華大學生命科學學院，博士研究生，研究方向為合成生物學；陳國強（通信作者），清華大學生命科學學院，清華大學化學工程系，清華大學合成與系統生物學中心，清華北大生命中心，綠色生物制造全國重點實驗室，教授，研究方向為工業生物技術、微生物聚羥基脂肪酸酯的合成與應用。

文章來 源 ： 陳江楠, 陳國強. 基于極端微生物代謝工程與合成生物學的“下一代生物制造技術”[J]. 科技導報, 2025, 43(23): 70?82 .

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