Nature?|?Cas12a3為基礎(chǔ)的細(xì)菌免疫新機(jī)制——RNA引導(dǎo)的tRNA尾部切割

撰文 |木蘭之枻

生物體抵御病毒感染主要有兩種途徑：清除入侵的病毒，或阻斷宿主細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制所必需的關(guān)鍵進(jìn)程。這其中t RNA 失活是阻斷病毒復(fù)制的一項(xiàng)重要機(jī)制【1】。例如，PrrC、VapC、大腸桿菌素E5和PARIS為代表的細(xì)菌防御系統(tǒng)均可通過切割特定tRNA的反密碼子環(huán)來實(shí)現(xiàn)抗病毒感染。在動(dòng)物體內(nèi)，I型干擾素SLFN11與SAMD9也可通過切割tRNA的受體莖部與反密碼子環(huán)以抑制特定密碼子的翻譯，最終阻止病毒顆粒的產(chǎn)生。

CRISPR- C as作為原核生物的獲得性免疫系統(tǒng)，是細(xì)菌抵抗外源病毒感染的有力武器【2】。研究表明，多種CRISPR系統(tǒng)在crRNA引導(dǎo)下可靶向切割病毒DNA或RNA，從而抑制病毒感染；部分被激活的Cas核酸酶還具備旁系切割活性，能夠非特異性地降解病毒相關(guān)的RNA或DNA，進(jìn)一步阻斷病毒復(fù)制。在已知的CRISPR抗病毒機(jī)制中，活化的 Lsh Cas13a可特異性識(shí)別并切割富含尿嘧啶（U）的靶標(biāo)序列，實(shí)現(xiàn)針對性抑制；同時(shí)，它也能非特異性地切割部分tRNA中富含U的反密碼子環(huán)【3】。然而， CRISPR系統(tǒng)能否通過特異性切割tRNA來實(shí)現(xiàn)抗病毒感染仍未有確切證據(jù)。

近日，來自德國亥姆霍茲RNA感染研究所的 Chase L. Beisel 實(shí)驗(yàn)室 與亥姆霍茲感染研究所的 D irk W. H einz 實(shí)驗(yàn)室 以及美國猶他州立大學(xué) Ryan N. Jackson 實(shí)驗(yàn)室合作， 在 N ature 發(fā)表題為 RNA-triggered Cas12a3 cleaves tRNA tails to execute bacterial immunity 的論文 。文章 對V型Cas 12 a 3 核酸酶的抗病毒免疫機(jī)制進(jìn)行了深入研究。研究首次證實(shí)活化的Cas 12 a 3 可對多種tRNA尾部進(jìn)行切割，從而引發(fā)生長停滯和抗噬菌體防御。冷凍電鏡結(jié)構(gòu)進(jìn)一步揭示，Cas12a3具有獨(dú)特的tRNA裝載結(jié)構(gòu)域，可將tRNA末端精準(zhǔn)定位至RuvC核酸酶活性中心。本研究揭示了新的C RISPR 抗病毒免疫機(jī)制，為未來的C RISPR 工具開發(fā)提供了新的方向。

文章伊始，研究者通過環(huán)境宏基因組數(shù)據(jù)挖掘和系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)了兩種新的Cas 12 a亞型Cas 12 a 3 和Cas 12 a 4 。它們在結(jié)構(gòu)上保留了經(jīng)典RuvC核酸內(nèi)切酶的關(guān)鍵基序，以及與crRNA加工、PFS識(shí)別等過程相關(guān)的功能域。不過Cas12a3缺失了與DNA旁系切割活性相關(guān)的蛋白結(jié)構(gòu)區(qū)域。質(zhì)粒干擾實(shí)驗(yàn)指出，激活后的Cas12a3與Cas12a4可通過與Cas 12 a 2 類似的方式引發(fā)生長停滯，但具體機(jī)制存在明顯差別。研究還發(fā)現(xiàn)，激活后的Cas 12 a 3 和Cas 12 a 4 可特異性切割 RNA 而非D NA 。體外轉(zhuǎn)錄-翻譯體系（TXTL assay）結(jié)合納米孔R(shí)NA測序分析證實(shí)，Cas12a3可特異性切割tRNA。其中激活后的 Ba1 Cas12a3可切割絕大多數(shù)tRNA（46/49），其切割位點(diǎn)主要位于tRNA 3 ’ 末端上游第3至5個(gè)堿基處。此外，無論tRNA是否發(fā)生化學(xué)修飾或是否攜帶氨基酸/功能基團(tuán)，Ba1Cas12a3均能對其進(jìn)行有效切割。

為闡明Cas12a3結(jié)合tRNA的具體機(jī)制，研究者利用單顆粒冷凍電鏡對 Ba1 Cas12a3-crRNA-靶RNA-tRNA復(fù)合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析。分析結(jié)果表明， Ba1 Cas12a3具有與 Su Cas12a2相似的REC1/2、WED、PI、RuvC、ZR等結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)插入結(jié)構(gòu)域。該插入結(jié)構(gòu)域的部分區(qū)域與 Su Cas12a2無顯著同源性，且在PDB數(shù)據(jù)庫中也未發(fā)現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)相似序列。研究發(fā)現(xiàn)，該結(jié)構(gòu)域可直接結(jié)合tRNA，并能協(xié)助將tRNA引導(dǎo)至RuvC活性中心，因此被命名為tRNA裝載結(jié)構(gòu)域（tRNA-loading domain，簡稱tRLD）。復(fù)合物結(jié)構(gòu)中， Ba1 Cas12a3結(jié)合cr RNA 的方式與Cas 12 a/Cas 12 a 2 類似。此外，靶R NA 會(huì)與cr RNA 形成A型雙螺旋，并貫穿蛋白中心區(qū)域，靶RNA的3 ’ PFS序列則由PI結(jié)構(gòu)域夾持。 Ba1 Cas12a3復(fù)合物最顯著的特征是與tRNA Ala(UGC) 在兩個(gè)位點(diǎn)有特異性相互作用，一是T臂的磷酸骨架可通過氫鍵被REC2域中的小環(huán)識(shí)別；二是受體莖部與3 ’ CCA末端被夾持在tRLD與RuvC結(jié)構(gòu)域之間。此外， Ba1 Cas12a3所結(jié)合的tRNA區(qū)域，與游離延伸因子EF-Tu或EF-Tu-核糖體復(fù)合物的結(jié)合區(qū)域相同，表明 Ba1 Cas12a3切割的是未參與蛋白質(zhì)合成的游離tRNA。

為深入探究 Ba1 Cas12a3核酸酶活化及tRNA切割過程中的動(dòng)態(tài)構(gòu)象變化，研究者利用冷凍電鏡技術(shù)，系統(tǒng)解析了 Ba1 Cas12a3-crRNA、 Ba1 Cas12a3-crRNA-靶RNA，以及 Ba1 Cas12a3- tRNA Ala(UGC) 3’ A CCA尾部等一系列結(jié)構(gòu)。分析表明，靶RNA的結(jié)合可誘導(dǎo) Ba1 Cas12a3-crRNA發(fā)生一系列構(gòu)象重排。與 Su Cas12a2不同（其靶RNA識(shí)別后的構(gòu)象變化即足以完成激活）， Ba1 Cas12a3中的tRLD結(jié)構(gòu)域在激活后仍穩(wěn)定位于RuvC活性中心附近。當(dāng)RuvC完成對tRNA尾部的切割后，tRNA主體發(fā)生解離，但其末端的四核苷酸ACCA仍被RuvC與tRLD結(jié)構(gòu)域捕獲。此時(shí)， Ba1 Cas12a3保持激活構(gòu)象并繼續(xù)捕獲切割其他tRNA。

C as12a3特異性切割tRNA的特性可直接用于多重RNA檢測。該檢測主要依賴于將Cas13核酸酶與正交RNA底物進(jìn)行配對。為提升多重檢測能力，需要引入具有不同正交底物偏好性的新型核酸酶。研究發(fā)現(xiàn)， Ba1 Cas12a3對帶有3 ’ CCA尾及3 ’ 熒光基團(tuán)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)具有最強(qiáng)的信號響應(yīng)。基于此，該酶可與靶向富含尿嘧啶（U）RNA序列的 Lwa Cas13a、以及靶向富含腺嘌呤（A）RNA序列的 Psm Cas13b聯(lián)用，共同實(shí)現(xiàn)多重RNA檢測。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，該組合系統(tǒng)可成功實(shí)現(xiàn)對SARS-CoV-2、呼吸道合胞病毒（RSV）及甲型流感病毒RNA轉(zhuǎn)錄本的高效檢測。

總體而言，本研究發(fā)現(xiàn)廣泛的tRNA失活是一種全新的CRISPR抗病毒免疫策略。研究者通過設(shè)計(jì)模擬tRNA受體莖部與末端的合成報(bào)告分子，有效拓展了CRISPR診斷技術(shù)在多重RNA檢測方面的應(yīng)用能力。

https://doi.org/10.1038/s41586-025-09852-9

制版人： 十一

參考文獻(xiàn)

1. Elder, J. J. H., Papadopoulos, R., Hayne, C. K. & Stanley, R. E. The making and breaking of tRNAs by ribonucleases.Trends Genet.40, 511–525 (2024).

2. Nussenzweig, P. M. & Marraffini, L. A. Molecular mechanisms of CRISPR–Cas immunity in bacteria.Annu. Rev. Genet.54, 93–120 (2020).

3. Jain, I. et al. tRNA anticodon cleavage by target-activated CRISPR–Cas13a effector.Sci. Adv.10, eadl0164 (2024).

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