Mol Cell | 史俊煒/譚凱等開發優化的CRISPR功能基因組學平臺用于急性髓系白恤病治療靶點的篩選

急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia，AML）是一種高度惡性的血液癌癥，具有未分化，異質性強且容易復發的特點。近些年多項針對AML進行的CRISPR基因篩選鑒定出大量AML特異性靶點【1-4】，但針對這些靶點的藥物在臨床試驗中效果欠佳【5】。其中一部分原因是這些篩選都是在細胞系模型或者小鼠模型上進行的，但這些模型并不能完全代表疾病本身。原代AML細胞雖然會是更貼近疾病本身的模型，但原代細胞難培養，病毒感染效率低，CRISPR敲除效率低，這些都導致了目前沒有成功在原代AML細胞實現CRISPR篩選的報道。

2026年2月26日，賓夕法尼亞大學醫學院 史俊煒 教授，費城兒童醫院 譚凱 教授和 Kathrin M. Bernt 教授合作 （ 史俊煒教授 實驗室博士研究生曹鎮東和博士后研究員于思翔為共同第一作者） 在Molecular Cell上發表了文章

CRISPR-based functional genomics for dissecting therapeutic dependency in primary acute myeloid leukemia samples

研究人員首先對已有的CRISPR篩選平臺做出了如下改進：1，將sgRNA或Cas9慢病毒載體上的抗生素抗性基因替換為熒光標簽，以避免抗生素篩選過程中對原代細胞異質性的影響；2，在Cas9慢病毒載體中引入更強的SFFV啟動子，增加Cas9蛋白的表達水平；3，改進sgRNA載體，使其穩定性增加【6】；4，使用Retronctin包被的平板【7】，并將濃縮的慢病毒富集在其表面，從而提高慢病毒的轉導效率。

為了驗證以上改進能否達到在原代AML樣品中進行CRISPR篩選的標準，研究人員選擇細胞表面蛋白CD33和CD44作為靶點。在22個原代病人樣本中，作者成功對其中19個原代樣本實現了單基因敲除。結合Cas9蛋白/sgRNA雙陽性率和表面蛋白的敲除效率，16個原代樣本可以進行CRISPR基因篩選，比例達到73%（16/22）。

在證明了優化的CRISPR平臺在原代AML樣品中的有效性后，研究人員繼而進行了以下3 種篩選：1，傳統CRISPR基因敲除篩選，以找出不同突變背景的原代AML細胞各自不同的“依賴基因”；2，CRISPRi基因干擾篩選，以找出原代AML細胞中發揮重要功能的順式作用元件；3，Perturb-seq擾動測序，利用更少量的細胞，找到影響AML生長的關鍵因子，同時可以看到關鍵因子是如何影響細胞分化狀態變化，細胞周期變化，轉錄組變化和不同亞群組成變化。

值得一提的是，在傳統CRISPR基因敲除篩選中，研究人員發現了不同突變背景的原代AML細胞對SETDB1和EP300敲除的反應有很大不同。SETDB1和EP300被普遍認為在AML細胞系中起到致癌驅動基因的作用【8,9】。但在原代細胞的篩選中，靶向EP300的sgRNA在MLL融合的亞型中減少，在IDH1或IDH2突變亞型中富集；相類似的是，靶向SETDB1的sgRNA在IDH1突變亞型中富集，在其他亞型中減少。這些結果表明，不同的突變背景會是細胞對完全不同的基因產生依賴，凸顯了在原代AML樣品上進行CRISPR篩選和靶點驗證的必要性。

隨后，研究人員將優化的CRISPR平臺擴展到CRISPRi基因干擾篩選以找到重要的順式作用元件。團隊選取了PDX（Patient-Derived Xenograft，PDX）。這個PDX模型來源于一位被確診為B細胞急性淋巴細胞白血病（ B-cell acute lymphoblastic ，B-ALL）的病人在接受了B細胞靶向療法后，腫瘤細胞經歷了細胞譜系轉換，轉變為 急性髓系白血病 AML【10】。 通過對比復發AML與原始B-ALL的單細胞測序數據，研究確立了44個候選基因，并設計了針對其啟動子和增強子的 CRISPR文 庫進行篩選。實驗不僅證實了 MYC 增強子模塊（ME1–ME5）對細胞增殖的關鍵作用，還 鑒定出位于 轉錄因子MYB的內含子區域 的增強子 （MYB_ATAC ）。

最后，研究人員利用Perturb-seq擾動測序技術，在多種突變背景的原代AML病人樣品中 系統解析了 與 白血病維持相關基因的功 能。結果表明，不同基因擾動可引起關鍵轉錄程序的變化，包括 HOXA 基因簇表達、MYC/MYB 調控、髓系分化標志物以及內源性逆轉錄病毒（ERV）激活。通過整合細胞數量變化、細胞周期組成以及白血病相關基因特征分析，研究發現 S 期細胞比例下降和增殖相關通路變化能夠預測基因必需性，為傳統 CRISPR篩選提供了替代或補充方法。進一步將 Perturb-seq 數據投射到正常造血分化軌跡上，揭示了不同基因擾動對 AML 細胞狀態及亞群組成的影響。

綜上所述，研究人員開發了一個優化的CRISPR功能基因組學平臺，首次在原代AML病人樣本中進行CRISPR篩選。這些篩選不僅驗證了已知的AML靶點，鑒定出了新的順式作用關鍵，更重要的是，揭示了在原代AML病人樣本中不同突變背景導致的完全不同的癌癥依賴性和細胞異質性。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.molcel.2026.02.003

制版人： 十一

參考文獻

1. Tzelepis, K. et al. A CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia.Cell Reports17 , 1193-1205 (2016).

2. Yamauchi, T. et al. Genome-wide CRISPR-Cas9 Screen Identifies Leukemia-Specific Dependence on a Pre-mRNA Metabolic Pathway Regulated by DCPS.Cancer Cell33 , 386-+ (2018).

3. Lu, B. et al. A Transcription Factor Addiction in Leukemia Imposed by the MLL Promoter Sequence.Cancer Cell34 , 970-+ (2018).

4. Cao, Z.D. et al. ZMYND8-regulated IRF8 transcription axis is an acute myeloid leukemia dependency.Mol Cell81 , 3604-+ (2021).

5. Kayser, S. & Levis, M.J. The clinical impact of the molecular landscape of acute myeloid leukemia.Haematologica108 , 308-320 (2023).

6. Jaitin, D.A. et al. Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq.Cell167 , 1883-+ (2016).

7. Hanenberg, H. et al. Colocalization of retrovirus and target cells on specific fibronectin fragments increases genetic transduction of mammalian cells.Nat Med2 , 876-882 (1996).

8. Cuellar, T.L. et al. ---Silencing of retrotransposons by SETDB1 inhibits the interferon response in acute myeloid leukemia--.Journal of Cell Biology216 , 3535-3549 (2017).

9. Giotopoulos, G. et al. The epigenetic regulators CBP and p300 facilitate leukemogenesis and represent therapeutic targets in acute myeloid leukemia.Oncogene35 , 279-289 (2016).

10. Chen, C.Y. et al. Single-cell multiomics reveals increased plasticity, resistant populations, and stem-cell-like blasts in KMT2A-rearranged leukemia.Blood139 , 2198-2211 (2022).

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