Nature Plants | 巫永睿/張余/王文琴聯(lián)合揭示植物質(zhì)體DNA復(fù)制中切除RNA引物的關(guān)鍵核酸酶及其作用機(jī)制

202 5 年 6 月 25 日，中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心巫永睿團(tuán)隊 聯(lián)合本中心張余團(tuán)隊以及上海師范大學(xué)王文琴團(tuán)隊 在NaturePlants上發(fā)表了題為 “PEN1catalysesRNA primer removal during plastid DNA replication in maize”的研究論文。 科研人員經(jīng)過八年不懈探索，揭示了植物質(zhì)體 DNA （ p tDNA ） 復(fù)制 體 中RNA引物切除的核心核酸酶組分plastid-localized and Mn2+-dependent 5’-3’exonuclease1( PEN1 )。 長期以來，植物 p tDNA 復(fù)制中負(fù)責(zé)RNA引物切除的核酸酶一直未被鑒定 到 ，而PEN1的發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了這一關(guān)鍵 領(lǐng)域 的空缺， 完善了 p tDNA 復(fù)制 理論。

DNA復(fù)制是生命科學(xué)的核心基礎(chǔ)問題之一。雙鏈DNA解旋后引物酶在模板鏈上合成RNA引物。前導(dǎo)鏈僅需 合成 一個RNA引物即可由 高持續(xù) 合成能力的DNA聚合酶實現(xiàn)連續(xù)延伸，而 滯后鏈則需 合成 多個RNA引物，通過不連續(xù)的岡崎片段合成方式完成復(fù)制 。 D NA 復(fù)制后，R NA 引物 由核酸酶 負(fù)責(zé) 切除 ，從而保證基因組的完整性。在原核生物中，如大腸桿菌， DNA聚合酶III是主要負(fù)責(zé)DNA復(fù)制的聚合酶，而DNA聚合酶I是負(fù)責(zé)切除RNA引物的酶。DNA聚合酶I除了具有聚合酶活性外，還具5′ - 3′外切酶活性。DNA聚合酶I在延伸DNA鏈時，同步利用其外切酶活性切除RNA引物，這 一 過程稱為缺口翻譯（Nick translation）。

在 內(nèi)共生過程中，光合藍(lán) 細(xì)菌 被非光合真核生物整合 共生 ，最終演變成了質(zhì)體。質(zhì)體 根據(jù) 其形態(tài)和功能的差異，主要分為葉綠體、淀粉體和有色體 等 ，它們分別在光合作用、淀粉合成和代謝調(diào)控中扮演著關(guān)鍵角色。盡管功能各異，但所有質(zhì)體都起源于共同的前體 （前 質(zhì)體 ） ，并 具有 相同的 遺傳物質(zhì) 。 質(zhì)體是半自主的細(xì)胞器 ， Pol1A和 1 B負(fù)責(zé) p tDNA 的復(fù)制； 然而， 其 缺乏 DNA聚合酶I 類似 的 5 ’ -3 ’ 外切酶結(jié)構(gòu)域 。因此，負(fù)責(zé) p t D NA 復(fù)制 過程 RNA引物 切除 的 核酸 酶的身份，長期以來一直是一個未解之謎。 擬南 芥 中，AtRNH1 C 可能參與 RNA引物 切除 ；然而 ， 這一過程并非完全高效， AtRNH1C 切割后 會在RNA-DNA連接處 殘留 1-3個 核糖核苷酸 ， 從而抑制 DNA片段的連接 。因此，研究人員推測還需要其他尚未被鑒定的質(zhì)體定位的核酸酶來完全切除RNA引物并允許DNA片段連接，從而確保ptDNA復(fù)制的成功完成。

2017年， 剛進(jìn)實驗室的研究生 黃興和 導(dǎo)師 巫 永睿 研究員 在山東泰安的夏季試驗田里，從 甲基磺酸乙酯 （EMS）誘變?nèi)后w分離 到 pen1 突變體。與之前報道的在世代間表現(xiàn)出穩(wěn)定 遺傳 表型的 籽粒 突變體不同， p en1 胚乳發(fā)育和 灌漿 存在缺陷，且 隨著世代繁衍 加劇的特征。值得注意的是， pen1 /+ 自交分離的純合突變體（ p en1 F2 ）的胚乳質(zhì)體發(fā)育僅 伴隨 輕微缺陷，而 p en1 F2 繼續(xù)自交后代（ p en1 F 3 ） 的 胚乳前質(zhì)體均不能正常分化 ，胚乳表現(xiàn)為完全空殼（圖1） 。

圖1：PEN1調(diào)控質(zhì)體發(fā)育

研究人員 成功 分離了 Pe n1 位點(diǎn) ，發(fā)現(xiàn)其編碼質(zhì)體 特異定位 的5 ’ -3 ’ 外切酶。PEN1與 p t DNA 復(fù)制 體 的其他成分（Pol1A/1B和 連接酶 LIG1） 共定位于 葉綠體 擬核 。研究表明，PEN1能高效切割RNA引物 切 除過程中間體 ，并 完全移除 RNA-DNA連接處 的 核糖核苷 酸，從而促進(jìn)了LIG1的連接。 研究人員 成功 在體外重建了由PEN1、Pol1A/1B和LIG1 介 導(dǎo)的質(zhì)體RNA引物去除過程 ， 證實P EN1 的確參與了 pt DNA 復(fù)制過程 R NA 引物移除 （圖2） 。

圖2：PEN1參與ptDNA復(fù)制RNA引物移除

此外， 研究人員 還解析了PEN1-雙鏈DNA二元復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu) 。 在 PEN1的催化中心，被切割DNA鏈的第1個核苷酸的5 ’ 單磷酸基團(tuán)與活性中心的Mg2+形成配位鍵、連接第2和第3個核苷酸的磷酸二酯鍵同時與K250、R264、R283形成三個鹽橋，這使得被切割DNA鏈在活性中心的相對位置被固定，從而使PEN1精確切割1和第2個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，發(fā)揮其核酸外切酶活性 。為了探究 P en1 突變對 p t DNA 的影響， 研究人員 通過分離 p tDNA 和De tail-Seq 發(fā)現(xiàn) Pen1 功能缺失 直接導(dǎo)致 p t DNA 的 斷裂， 且 斷點(diǎn) 主要積累在 p tDNA 正義 鏈上。 同時 ， 研究人員還發(fā)現(xiàn) Pen1 功能缺失抑制了 p t DNA 的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄 活性 ，從而影響了質(zhì)體的正常發(fā)育和功能 （圖3） 。

圖3：PEN1對于維持ptDNA的完整性至關(guān)重要

對質(zhì)體遺傳和復(fù)制機(jī)制的系統(tǒng)性闡述，對于理解質(zhì)體發(fā)育和推動植物遺傳工程至關(guān)重要。盡管已鑒定出越來越多參與ptDNA復(fù)制的因子，但負(fù)責(zé)移除RNA引物的特定組分一直不明確。該研究鑒定到的質(zhì)體特異性的5’-3’外切酶PEN1能直接催化質(zhì)體DNA復(fù)制過程中RNA引物的移除，并闡明了其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。這些發(fā)現(xiàn)為質(zhì)體復(fù)制（尤其是RNA引物移除過程）提供了深刻的見解，助于推動作物改良的質(zhì)體遺傳工程進(jìn)展。

中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心 博士后黃興，博士生石國龍以及已畢業(yè) 博士肖俏（現(xiàn)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)博士后） 為本研究論文 的 共同第一作者，巫永睿和張余研究員 以及上海師范大學(xué)王文琴教授 為 通訊作者 。 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)黃永財教授，上海師范 大學(xué)研究生馮嬌嬌等參與了該研究。 清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生物學(xué)研究中心孫前文 副教授和張衛(wèi)峰博士在 p t D NA 損傷檢測 提供了大量幫助。該 研究 工作得到了 科技部 重點(diǎn)研發(fā)計劃 、 國家 自然科學(xué)基金 重點(diǎn)和青A延續(xù)， 中國科學(xué)院 先 導(dǎo) B ， 尚思探索學(xué)者和 國家資助博士后B類 等 項目的資助。

論文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41477-025-02027-4

巫永睿研究團(tuán)隊長期聚焦于玉米高蛋白形成 調(diào)控 和胚乳發(fā)育 關(guān)鍵關(guān)鍵 基因的克隆和機(jī)理解析 。在 Nature, Nature Communications, Nature Plants, PNAS, The Plant Cell等雜志上發(fā)表 高水平論文 60余篇。2014年獲得基金委優(yōu)秀青年基金資助，2018年入選科技部中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才，2019年獲得國家杰出青年基金資助，2021年入選“中國科學(xué)院優(yōu)秀研究生導(dǎo)師”，2023年獲“科學(xué)探索獎”，2024年獲“尚思探索學(xué)者” ，2 025 年獲青 年科學(xué)基金項目（A類）延續(xù)資助 。 現(xiàn) 公開 招聘博士后2 - 4 名 。詳情請參見 :

http://www.cemps.cas.cn/zxns/202212/t20221206_6566655.html