抗柯薩奇病毒A組6型中和抗體效價檢測方法建立及驗證

中文摘要

目的應用微量致細胞病變（micro-cytopathic effect，CPE）法建立抗柯薩奇病毒A組6型（coxsackievirus A6，CV-A6）中和抗體檢測方法并進行方法學驗證。

方法用人橫紋肌瘤細胞和CV-A6檢測毒株建立基于CPE的中和抗體檢測方法，并對相對準確度、精密度、線性、專屬性和耐用性等進行驗證。

結果建立了針對CV-A6免疫血清的中和抗體效價測定方法。3份不同稀釋度（1×、16×、256×）的血清參考品各測定3次，相對偏倚分別為-2%、-4%、-16%，擬合線性回歸斜率為1.065，相對準確度良好；幾何變異系數（geometric coefficient of variation，GCV）為19%～50%，重復性良好。取10份小鼠免疫血清于不同天測定3次中和抗體效價，GCV為0%～75%，中間精密度良好。將抗CV-A6中和抗體血清參考品稀釋9個稀釋度，獨立測定3次，擬合直線的回歸系數為0.93，直線回歸具有統計學意義（F=340.99，P＜0.000 1）。陰性血清中和效價均＜8，表明專屬性良好。不同細胞代次、不同細胞密度、不同病毒載量、不同培養時間、待檢血清反復凍融不同次數及短暫儲存時間范圍的GCV為23%～101%，表明該方法耐用性良好。

結論成功建立了抗CV-A6中和抗體檢測方法，該方法具有較好的相對準確度、精密度、線性、專屬性及耐用性，可用于評價CV-A6免疫血清的中和抗體水平。

正文

20世紀80年代，中國手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）病原體以腸道病毒A組71型（enterovirus A71，EV-A71）和柯薩奇病毒A組（coxsackievirus A，CV-A）16型（CV-A16）交替或共流行為主。2013年，CV-A6在中國大陸成為HFMD的主要病原，且其傳播能力高于EV-A71和CV-A16。CV-A6屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬，是單股正鏈RNA病毒，可導致成人輕型或非典型HFMD。由于目前仍無針對CV-A6感染的治療藥物，因此研發安全有效的CV-A6疫苗對控制HFMD的流行非常重要，而中和抗體水平是評價疫苗效力的關鍵指標。中和抗體水平的檢測方法主要包括微量致細胞病變中和試驗（micro-cytopathic effect neutralization test，MCPENT）、酶聯免疫斑點法中和試驗、假病毒中和試驗及采用活病毒的噬斑減少中和試驗。傳統的MCPENT雖耗時長，但其結果可靠且具有高度特異性；酶聯免疫斑點法中和試驗雖檢測時間顯著縮短，但其操作復雜，結果解讀主觀性強，對樣本處理要求高，不能直接定量中和抗體水平；假病毒中和試驗雖安全性高，高通量，靈敏度高，但假病毒構建復雜，成本高，不能完全模擬真實病毒；噬斑減少中和試驗雖具有高靈敏度和特異性等優點，但其操作復雜、耗時且需要高生物安全級別的實驗室，限制了其在大規模檢測中的應用。MCPENT是中和抗體檢測的金標準，國內外多采用該法進行檢測。本研究擬基于該法建立抗CV-A6中和抗體效價測定方法，并對其相對準確度、精密度、線性、專屬性和耐用性進行方法學驗證，實驗嚴格遵循中國藥典2020年版三部（藥典三部）通則9401“生物制品生物活性/效價測定方法驗證指導原則”進行設計，數據統計與分析均按該通則要求執行，以為評價含CV-A6的HFMD疫苗免疫原性提供依據。

1

材料與方法

1.1

材料

1.1.1　細胞、毒種、血清人惡性胚胎橫紋肌肉瘤（human rhabdomyosarcoma，RD）細胞由北京民海生物科技有限公司（北京民海）研發中心保存，CV-A6檢測毒株（批號：W-A6-20201101）、中和抗體血清參考品（廣譜）（批號：PR-202104001）、抗CV-A6中和抗體血清參考品（批號：A6-202104001）、中和抗體血清參考品（陰性）（批號：NR-202104001）、四價疫苗中和抗體效價測定小鼠陰性血清（編號：Z-1—Z-10）、四價疫苗中和抗體效價測定小鼠免疫血清（編號：1-1—1-10、2-1—2-10、3-1—3-10）均由北京民海自行制備。

1.1.2　主要試劑與儀器最低必需培養基（minimum essential medium，MEM）購自日本日水制藥株式會社，胎牛血清、胰蛋白酶、L-谷氨酰胺、青霉素-鏈霉素溶液均購自美國Gibco公司，無水碳酸氫鈉購自國藥集團化學試劑有限公司。CKX53倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司，MCO-20AIC二氧化碳培養箱購自日本Panasonic公司，AC2-6S8-CN生物安全柜購自蘇州安泰空氣技術有限公司，Countstar全自動細胞計數儀購自美國Inno-Alliance Biotech公司。

1.1.3　溶液配制MEM溶液：稱取9.4 g MEM，加入注射用水至1 L，充分溶解，于121 ℃、30 min高溫滅菌。7.5%碳酸氫鈉溶液：稱取無水碳酸氫鈉75 g溶于1 L注射用水，除菌過濾。L-谷氨酰胺溶液：稱取L-谷氨酰胺29.2 g溶于注射用水，定容至1 L，除菌過濾。病毒稀釋液（以下配比均為體積分數）：MEM溶液+2%胎牛血清+2%碳酸氫鈉溶液（質量分數為7.5%）+1% L-谷氨酰胺溶液+1%青霉素-鏈霉素溶液。細胞培養液：除胎牛血清為10%外，其他成分同病毒稀釋液。

1.2

抗CV-A6中和抗體檢測方法建立

參照文獻［20］中抗CV-A16中和抗體檢測方法的實驗室評價中和抗體檢測方法，建立抗CV-A6中和抗體檢測方法：將待檢樣品進行1∶8稀釋，56 ℃水浴滅活30 min后，100 μL/孔加至96孔板中；對其2倍系列稀釋后，分別與100 CCID50的CV-A6病毒液于（37±1） ℃中和2 h。加入1.0×105 mL-1的RD細胞懸液，100 μL/孔，置于（35±1） ℃、5% CO2培養箱中培養7 d。將能抑制50%細胞病變的最高稀釋度定為抗CV-A6抗體的中和效價，并以稀釋度（1∶x）表示。每次均設病毒回滴實驗，回滴結果在32~320 CCID50/孔時，實驗判為成立。以中和抗體效價≥8判定為抗CV-A6中和抗體陽性，中和抗體效價＜8判定為陰性，陰性樣品的幾何平均滴度（geometric mean titer，GMT）均按4計算。

1.3

抗CV-A6中和抗體檢測方法驗證

1.3.1相對準確度取抗CV-A6中和抗體血清參考品1份，進行1×、16×、256×系列稀釋后作為獨立的血清樣本，用1.2建立的抗CV-A6中和抗體檢測方法進行檢測，每個樣本測定3次。計算每個稀釋倍數中和抗體效價測定值的相對偏倚（relative bias，RB）。計算公式為：RB=（log2效價測定值/效價理論值-1）×100%。以中和抗體效價理論值（log2）為橫坐標，以中和抗體效價測定值（log2）為縱坐標，進行直線回歸，計算回歸方程的斜率。每個稀釋倍數中和抗體效價測定值的RB應在±20%內，直線回歸方程的斜率應在0.80～1.25。

1.3.2　精密度

1.3.2.1　重復性取抗CV-A6中和抗體血清參考品，進行1×、16×、256×系列稀釋后作為獨立的血清樣本，按照1.2建立的方法進行中和抗體效價測定，每個待檢樣品獨立測定3次。計算測定結果的GMT、幾何變異系數（geometric coefficient of variation，GCV）。GCV應≤150%。

1.3.2.2　中間精密度取10份小鼠免疫血清（編號：1-1—1-10），按照1.2建立方法進行中和抗體效價測定，在不同天進行3次獨立測定。計算測定結果的GMT、GCV。GCV應≤150%。

1.3.3　線性取抗CV-A6中和抗體血清參考品，進行1、8、16、32、64、128、256、512、1 024倍稀釋后作為獨立的血清樣本，按照1.2建立方法進行中和抗體效價測定（其中256×、512×、1 024×不作8倍稀釋），每個待檢樣品獨立測定3次。以中和抗體效價理論值（log2）為橫坐標，中和抗體效價測定值（log2）為縱坐標作圖，采用最小二乘法進行線性回歸。直線回歸應具有統計學意義。

1.3.4　專屬性取中和抗體血清參考品（陰性）和小鼠陰性血清，將待測樣品以1∶8稀釋（30 μL樣品+ 210 μL病毒稀釋液），其余按照1.2建立方法進行中和抗體效價測定。測定的效價應<8。

1.3.5　耐用性

1.3.5.1　不同細胞代次對中和試驗檢測結果的影響取中和抗體血清參考品（廣譜），分別使用第63、66、70代次的RD細胞按照1.2建立的方法進行中和抗體效價測定，重復3次，每次測定每個細胞代次1次。計算3次測定結果的GMT、GCV。GCV應≤150%。

1.3.5.2　不同細胞密度對中和試驗檢測結果的影響取中和抗體血清參考品（廣譜），按照1.2建立方法進行中和抗體效價測定，設置3組接種細胞密度，分別為0.8×105、1.0×105和1.5×105 mL-1，重復3次，每次測定每個細胞密度1次。計算不同細胞密度測定結果的GMT、GCV。GCV應≤150%。

1.3.5.3　不同培養時間對中和試驗檢測結果的影響取中和抗體血清參考品（廣譜），按照1.2建立的方法進行中和抗體效價測定，共進行3次試驗，每次試驗測定1次，并在培養的第6、7、8天分別進行結果判定。計算不同培養時間測定結果的GMT、GCV。GCV應≤150%。

1.3.5.4　不同病毒載量對中和試驗檢測結果的影響取中和抗體血清參考品（廣譜），分別使用含有50、100、200 CCID50/0.05 mL病毒載量的病毒液，按照1.2建立方法進行中和抗體效價測定，重復3次，每次測定1次。計算含不同病毒載量病毒液測定結果的GMT、GCV。GCV應≤150%。

1.3.5.5　血清反復凍融對中和試驗檢測結果的影響將10份小鼠免疫血清（編號：2-1—2-10）分別反復凍融1、3次并分別測定1次中和抗體效價，按照1.2建立的方法進行中和抗體效價測定，計算測定結果的GMT、GCV。GCV應≤150%。

1.3.5.6　血清短暫儲存對中和試驗檢測結果的影響將10份小鼠免疫血清（編號：3-1—3-10）分別在（5±3） ℃放置3 d、-60 ℃及以下放置3 d，按照1.2建立的方法進行中和抗體效價測定。計算測定結果的GMT、GCV。GCV應≤150%。

1.4

統計學分析

中和抗體效價以2為底取對數后進行統計學分析，應用Excel 2016版軟件計算中和抗體GMT和GCV；應用JMP Pro 17軟件，對相對準確度、中間精密度結果進行線性回歸分析。應用GraphPad Prism 8軟件對耐用性結果進行繪圖分析。

2

結果

2.1

相對準確度

用1×、16×、256×系列稀釋的抗CV-A6中和抗體血清參考品3次測定的中和抗體效價RB均在±20%內，見表1；以中和抗體效價理論值（log2）為橫坐標，以中和抗體效價測定值（log2）為縱坐標，進行直線回歸，回歸方程為y=-1.091+1.065x，斜率（1.065）在0.80~1.25范圍內。

2.2

精密度

2.2.1　重復性用1×、16×、256×系列稀釋的抗CV-A6中和抗體血清參考品3次測定的中和抗體效價結果的GCV分別為50%、19%、27%，均在驗證標準范圍內，見表2。

2.2.2　中間精密度四價疫苗中和抗體效價測定小鼠免疫血清（編號：1-1—1-10）3次測定的中和抗體效價結果的GCV≤75%，在驗證標準范圍內，見表3。

2.3

線性

1×、8×、16×、32×、64×、128×、256×、512×、1 024×系列稀釋的抗CV-A6中和抗體血清參考品測定的中和抗體效價結果，采用最小二乘法進行線性回歸，結果見圖1。擬合直線回歸方程為y=-2.294+1.177x，決定系數為0.93。經F檢驗發現，直線回歸具有統計學意義（F=340.99，P＜0.000 1）。

2.4

專屬性

中和抗體血清參考品（陰性）及小鼠陰性血清的中和抗體效價均＜8，符合驗證標準。

2.5

耐用性

2.5.1　細胞代次使用第63、66、70代的RD細胞3次測定中和抗體血清參考品（廣譜）的中和抗體效價（1∶x）分別為4 096、6 144、4 096；GCV為27%，在驗證標準范圍內。

2.5.2　細胞密度使用密度分別為0.8×105、1.0×105和1.5×105 mL-1的RD細胞3次測定中和抗體血清參考品（廣譜）效價結果的GCV為44%，在驗證標準范圍內，見圖2。

2.5.3　培養時間在培養第6、7和8天3次測定中和抗體血清參考品（廣譜）效價結果的GCV為23%，在驗證標準范圍內，見圖3。

2.5.4　病毒載量使用病毒載量分別為50、100和200 CCID50/0.05 mL的病毒液3次測定中和抗體血清參考品（廣譜）效價結果的GCV為79%，在驗證標準范圍內，見表4。

2.5.5　反復凍融小鼠免疫血清反復凍融1、3次比較，測定中和抗體效價結果的GCV≤101%，在驗證標準范圍內，見圖4。

2.5.6　短暫儲存小鼠免疫血清在（5±3） ℃放置3 d與-60 ℃及以下放置3 d比較，測定中和抗體效價結果的GCV≤64%，在驗證標準范圍內，見圖5。

3

中和抗體效價檢測結果的準確性及實驗方法的標準化在CV-A6的血清流行病學調查及疫苗研發中具有重要意義。目前，抗脊髓灰質炎病毒、EV-A71及CV-A16中和抗體檢測方法多采用微量致細胞病變（micro-cytopathic effect，CPE）法，CPE法是腸道病毒中和抗體檢測的“金標準”。本研究借鑒抗脊髓灰質炎病毒、EV-A71及CV-A16中和抗體檢測的經驗，建立了基于CPE法的抗CV-A6中和抗體檢測方法，在統一檢測方法的基礎上，對該方法中的關鍵影響因素及性能（相對準確度、精密度、線性、專屬性、耐用性）進行了方法學驗證。

該方法的相對準確度驗證檢測結果的RB分別為-2%、-4%、-16%，回歸方程斜率為1.065；重復性檢測結果的GCV分別為50%、19%、27%；中間精密度檢測結果的GCV≤75%；將抗CV-A6中和抗體血清參考品稀釋9個稀釋度，獨立測定3次，擬合直線的回歸系數為0.93，直線回歸具有統計學意義；中和抗體血清參考品（陰性）及10份小鼠陰性血清的中和抗體效價均＜8。耐用性測試中對細胞代次、細胞密度、培養時間、病毒載量、短暫儲存、反復凍融等條件影響因素進行了研究。細胞代次會影響毒種在細胞中的增殖效率和穩定性，也會影響細胞的遺傳變異，傳代次數過高可能導致細胞對毒種的敏感性降低，從而影響毒種檢測結果的可靠性。細胞密度會影響營養物質和代謝產物濃度，細胞間接觸抑制可能會影響毒種的增殖效率和檢測結果的穩定性。病毒培養時間會影響病毒的復制周期及細胞生長狀態。病毒載量會影響抗體中和作用，病毒載量過高可能導致細胞病變過快，影響實驗終點的判斷，過低則可能導致病變不明顯，難以確定中和效果。在實際操作過程中，待檢測的血清會在（5±3） ℃放置一段時間，在取樣過程中血清也會出現反復凍融的問題。基于此，本研究對以上6個影響因素進行了驗證，驗證結果的GCV均≤150%。以上驗證結果均符合方法學驗證的可接受標準。

中和抗體效價檢測結果的準確性不僅與標準血清的使用有關，也與檢測毒株的選用密切相關。目前雖已有市售的抗CV-A6中和抗體國家標準品，能為該檢測方法的標準化提供一定依據，但尚無市售的國家標準檢測毒株。本實驗室此前建立了1批具有良好專屬性及適用性的CV-A6檢測毒株，本研究進一步補充了抗CV-A6中和抗體檢測用毒株病毒滴度標定及其專屬性和適用性評價中的方法學驗證部分。

綜上所述，本研究初步建立了抗CV-A6中和抗體檢測方法，且該方法的相對準確度、精密度、線性、專屬性、耐用性等均符合藥典三部通則9401要求，可用于抗CV-A6中和抗體效價的檢測，可為包含CV-A6的HFMD多價預防性疫苗的質量控制和工藝開發提供參考。

作者

謝學超 王笑天 黃仕 陳磊 趙麗麗 李國順 顧美榮 張改梅

北京民海生物科技有限公司，北京市新型聯合疫苗工程技術研究中心，北京 102600

通信作者：張改梅，

Email：gaimei0809@126.com

引用本文：謝學超, 王笑天, 黃仕, 等.抗柯薩奇病毒A組6型中和抗體效價檢測方法建立及驗證[J]. 國際生物制品學雜志, 2025, 48(5): 350-356.

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20241114-00078

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