Immunity | 細胞特異性順式調控元件和轉錄因子環路決定FOXP3表達

撰文 | 風

譜系決定因子由順式調控元件（cis-regulatory elements，CREs）緊密調節以確保其細胞特異性表達。這些譜系轉錄因子基因常常具有包括多個CREs的超級增強子，通過與相應的轉錄因子（Transcription factor，TF）和反式調控因子（trans-regulatory factors）作用，整合來自細胞內外多種信號，從而實現對基因表達的時空精確控制【1】。雖然染色質圖譜研究可以提供候選CREs-TF的快照，但非編碼序列和TF相關的綜合擾動性研究對于確定關鍵調控因子至關重要。考慮到免疫細胞的可塑性和異質性以及功能上的差異性，這樣的研究在免疫細胞中尤其重要。

CD4 T細胞是適應性免疫應答的重要構成細胞，可大致分為促炎的傳統T細胞（conventional T cell，Tcon）和抗炎的調節性T細胞（regulatory T cell，Tregs）。其中，Foxp3是Treg的關鍵轉錄因子和標志物。盡管小鼠中Foxp3只表達在Treg，研究表明在人體內Foxp3不僅在Treg構成性表達，也可以短暫表達在Tcon并具有調控活化的功能【2,3】。目前小鼠中已經鑒定到多個調節Foxp3表達CREs。4個保守非編碼序列（conserved non-coding sequence，CNS）作為增強子分布在其基因附近，包括CNS0-3。CNS0位于Foxp3啟動子上游，在胸腺Treg發育中調節IL-2誘導的Foxp3表達【4】；CNS1和CNS2位于Foxp3第一個內含子中，CNS1促進外周誘導型Treg分化和Foxp3的表達，CNS2維持Foxp3基因的長期、穩定表達和繼承【5】；CNS3位于Foxp3第2個內含子，負責Foxp3在胸腺和外周Treg發育中Foxp3的重新表達【5】。盡管如此，在人Treg中以及人Tcon中短暫表達的Foxp3的CREs和TF仍缺乏系統性研究。

近日，美國格萊斯頓-加州大學舊金山分校基因組免疫學研究所Alexander Marson團隊在Immunity上發表了題為FOXP3 expression depends on cell-type-specific cis-regulatory elements and transcription factor circuitry的研究文章。該研究使用CRISPR在人Treg和Tcon建立FOXP3表達的CRE-TFs調節環路，并鑒定到CNS0和NS-序列分別是Tcon中FOXP3表達的正向和負向CRE，進一步深化對FOXP3表達的理解，為精確靶向Treg治療炎癥性疾病提供新的策略。

為了系統性評估人原代Treg和Tcon中FOXP3的CREs，團隊設計CRISPRi tiling screen策略在FOXP3的轉錄起始位點（TSS）上游85kb至下游39kb范圍內逐一敲除基因片段，隨后再刺激48小時誘導FOXP3表達，通過流式分選分析FOXP3的表達狀態（分布兩端的25%分別為低表達或高表達）。因此，Foxp3低表達組的gRNAs負責正向調節FOXP3表達而Foxp3高表達組的gRNAs則為負向調節FOXP3表達。結果證實在人Treg中，TSS最為影響FOXP3表達。此外，多個正向調節FOXP3表達的gRNAs富集在最開始的8kb片段內，包括CNS1、CNS2和CNS3。不同于小鼠成熟Treg，團隊發現人Treg需要CNS0維持Foxp3表達。不僅如此，作者鑒定到距離Foxp3的TSS上游1.1kb，在小鼠中稱為Flicr的lncRNA負向調節FOXP3的表達。相比于Treg，CNS1、CNS2和CNS3在Tcon中似乎并不是FOXP3表達所必須。相反，TSS和CNS0對于Tcon中FOXP3的表達至關重要。意外的是，在TSS上游11.8kb長度為2kb的非編碼序列（positive non-coding sequence，NS+）在Tcon中促進FOXP3表達。隨后，作者使用正交CRISPR刪除策略在靜息和激活Treg和Tcon中敲除FOXP3的TSS、FLICR、CNS0和NS+，進一步證實在靜息和激活Treg中TSS和CNS0促進而FLICR抑制FOXP3表達，在激活尤其是靜息Tcon中TSS、CNS0和NS+促進FOXP3表達。值得注意的是，敲除臨近基因PPP1R3F的啟動子和TSS區域而非PPP1R3F引起Tcon細胞FOXP3表達顯著增加，表明臨近PPP1R3F的啟動子的非編碼序列調節FOXP3表達，作者將其稱為NS-。總之，上述結果表明在人Treg，CNS0-3促進而FLICR抑制FOXP3表達；在人Tcon，CNS0和NS+促進而NS-抑制FOXP3表達。緊接著，作者使用ATAC-seq、CHIP-seq和甲基化檢測證實CNS0、NS+和NS-具有CREs的性質，即存在相匹配的組蛋白乙酰化、DNA甲基化和染色質可即性。隨后，團隊使用CRISPRoff技術在Tcon中研究CNS0、NS+和NS-位點表觀沉默的功能效應。亞硫酸鹽測序證實CRISPRoff特異性在CNS0、NS+和NS-位點而非CNS2等位點維持高甲基化。CRISPRoff靶向CNS0和NS+均抑制Tcon中FOPX3的誘導表達，而靶向NS-則促進FOXP3的表達。有意思的是，同時靶向CNS0、NS+和NS-則幾乎廢除FOXP3的表達，表明沉默NS-誘導FOXP3表達需要CNS0和NS+處于激活狀態。

為了尋找FOXP3重要的轉錄因子，作者使用類似的CRIPSR篩選策略。在Treg中，除了小鼠中確認的TF，如CBFB、GATA3、ATXN7L3、USP22和 STAT5A，還發現FOXP3的表達依賴中介體復合物如MED11、MED12、MED14和MED33，而SATB1和SRF抑制FOXP3表達。另外，分析鑒定YBX1也是FOXP3的負調節因子，這在小鼠研究中沒有報道。在Tcon中，一部分正向TF與Treg共享，包括GATA3、 STAT5A/STAT5B和ATXN7L3；負向TF包括甲基化相關因子（DNMT1和MBD2）、和Treg共享因子（YBX1、SATB1和EGR2）以及獨特存在于Tcon如TFDP1和ETS1。隨后的敲除實驗證實這些正向和負向TF在Treg和Tcon中的調控作用。緊接著，作者使用CHIP驗證這些TFs是否直接結合在FOXP3的CREs。在Treg中，正向TFs主要結合正向調節CREs，例如STAT5結合在CNS0和CNS2，HIC1結合在TSS和NS+。負向TFs也存在于正向調節CREs，例如SATB1結合在TSS、CNS0和CNS2，提示增強子存在正負調節TFs的平衡。類似地，在Tcon中，正向TFs如GATA3、STAT5B和BCL11B結合在CNS0， STAT5B也能結合在NS+；負向TFs如SATB1、EGR2和MBD2也能結合在CNS0。與此同時，團隊也篩選到負向NS-位點可以結合負向TFs如EGR2、ETS1、DNMT1、TFDP1和MBD2，也能結合正向TFs如BCL11B和YY1，再次表明CRE中正負TFs的平衡。隨后，TFs敲除結合ATAC-seq分析發現GATA3和STAT5的敲除分別明顯降低CNS0和NS+位點的染色質可即性。總之，這些數據表明多種順式調節因子結合在CNS0、NS+和NS-等CREs調節染色質可即性控制FOXP3表達。

最后，作者試圖揭示人和小鼠Tcon中FOXP3表達的差異機制。首先，作者假設NS+由于在人和鼠中只有部分保守而允許人Tcon表達FOXP3。然而，作者發現小鼠CNS0和NS+具有與人類似的增強子活性，也存在正向TFs的結合，提示CNS0和NS+區域的染色質活性并不足以誘導Foxp3表達。隨后，作者假設NS-在小鼠也能抑制Foxp3表達且比人活性更強。預測分析發現相比于人，小鼠NS-序列與EGR2、TFDP1和E2F3的親和力更強，提示NS-是小鼠Tcon細胞Foxp3表達的強力抑制CRE。為此，作者使用CRISPR技術在小鼠Tcon中敲除NS序列確實誘導Foxp3的表達。此外，沒有單一的TFs敲除可以誘導小鼠Tcon表達Foxp3，提示TFs可能存在冗余。然而，EGR2突變則可以誘導Foxp3表達，但強度不如NS-序列敲除明顯。總之，這些數據表明小鼠NS-序列同樣抑制Foxp3表達。

綜上所述，這項研究通過CRISPR篩選在人Treg和Tcon構建FOXP3表達的特異性CREs和TFs調控環路，在人Treg，CNS0-3促進而FLICR抑制FOXP3表達，在人Tcon，CNS0和NS+促進而NS-抑制FOXP3表達。此外，該研究揭示NS-與TFs的親和力不同是人和鼠Tcon中Foxp3表達差異的原因。總之，該研究不僅促進對FOXP3表達的理解，也為靶向Treg的疾病治療提供新的思考。

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2025.10.020

制版人： 十一

參考文獻

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