Nature?|?引導編輯技術應用新突破——劉如謙團隊利用內源tRNA重編程實現無義突變遺傳病的廣譜治療

撰文 |木蘭之枻

自CRISPR相關基因編輯技術問世以來，患者特異性的基因編輯治療已步入快車道，目前全球范圍內已有超過70項相關臨床研究正在推進。盡管在療效方面展現出顯著潛力，但現有策略大多仍停留于“一人一策”的高度定制化模式，治療方案普遍缺乏普適性。因此，在面對涉及20萬種已知致病突變、涵蓋超過8000種遺傳病的龐大患者群體時，要實現廣泛有效的治療，仍面臨諸多挑戰。在眾多遺傳變異中，約24%的致病突變屬于導致提前出現終止密碼子（PTCs）的“無義突變（nonsense mutation）”【1】。針對此類突變，研究者開發了一類特殊的抑制型tRNA（suppressor tRNA,sup-tRNA），能夠在UAA、UAG或UGA這類終止密碼子處插入氨基酸，實現無義突變的通讀，從而恢復功能性蛋白質的表達，達到緩解患者癥狀的效果【2-3】。然而，現有sup-tRNA策略多依賴LNP或AAV介導的外源遞送系統，為維持治療效果常需反復給藥并外源過表達sup-tRNA，可能帶來長期安全性風險。

人類基因組編碼了47個同功受體tRNA家族（即冗余tRNA），這是密碼子簡并性的基礎。此外，多數tRNA以多拷貝基因形式存在，上述47個tRNA家族共包含418個高置信度基因。這種冗余特性使得人類能耐受大量tRNA突變，其中包括可形成天然sup-tRNA或導致錯載tRNA的反密碼子突變。此外，研究顯示即使完全刪除某些tRNA家族，也未觀察到明顯的表型后果【4-6】。內源tRNA的冗余特性和對突變的高耐受度為其改造與重編程奠定了基礎。但如何實現內源tRNA基因向sup-tRNA的改造仍缺乏研究。

近日，美國哈佛大學David R. Liu實驗室在Nature雜志上發表了題為Prime editing-installed suppressor tRNAs for disease-agnostic genome editing的論文。文章基于引導編輯（prime editing）開發出一種PTCs通讀策略PERT（prime editing-mediated readthrough of premature termination codons）用于無義突變相關遺傳病的治療。研究者通過對內源tRNA的系統性篩選和飽和突變改造，將功能冗余的tRNA重編程為內源性的sup-tRNA，從而為多種遺傳病患者提供了全新的治療思路和策略。

前期驗證性實驗發現，對兩種內源tRNA進行簡單改造（反密碼子突變為CUA, UCA或UUA）后得到的低拷貝sup-tRNA活性偏低。為系統鑒定在低拷貝表達下仍能有效促進終止密碼子通讀的sup-tRNA，研究者設計了三種引導編輯篩選方案，對418個冗余tRNA基因位點進行了系統性評估。篩選結果表明，編碼Arg、Leu、Tyr和Ser的tRNA可被重編程為通讀TAG終止密碼子的sup-tRNA；而編碼Leu和Arg的tRNA則能夠進一步被改造為通讀TGA終止密碼子的sup-tRNA。不過當前改造的sup-tRNA活性仍有待進一步提升。

隨后研究者對tRNA基因的前導序列、tRNA基因本體和終止序列等三大核心元件進行篩選以分析其對sup-tRNA活性的影響。前期篩選發現，外源啟動子會干擾多種sup-tRNA的表達。后續研究通過對11543種“前導序列–sup-tRNA–終止序列”組合進行篩選后發現， tRNA自身的內源性前導序列與TTTTT終止序列能更好的維持sup-tRNA活性。為進一步提升sup-tRNA活性，研究者優選三種人源sup-tRNAs (tRNA-Arg-CCT-4-1,tRNA-Tyr-GTA-2-1 and tRNA-Leu-TAA-4-1) 以及一種小鼠sup-tRNA對tRNA本體進行飽和突變篩選。篩選發現了多種可增強sup-tRNA活性的點突變和配對堿基替換。隨后研究者以基礎活性最高的sup-tRNA （tRNA-Leu-TAA）為基礎，對增益突變進行組合篩選，結果顯示優選突變組合僅需對野生型tRNA-Leu-TAA-1-1基因進行6bp替換，這可以通過引導編輯高效實現。研究還指出，tRNA反密碼子莖環區突變的增益效果可部分歸因于細胞內表達豐度的提升。

之后研究者對引導編輯策略進行系統性優化，以期實現對內源tRNA的高效編輯，最終獲取具有PTCs高通讀活性的內源性sup-tRNA。初步篩選指出，PE6c編輯器的編輯效率最高。基于此，研究者進一步結合ngRNA為基礎的PE3/PE3b系統，在HEK293T細胞中實現了60%–80%的內源tRNA編輯效率，較早期不足8%的效率水平取得了顯著提升。為評估潛在的基因組脫靶風險，研究者采用了兩種獨立的檢測策略，結果均未發現明顯的脫靶編輯事件。進一步的轉錄組學與蛋白質組學分析也表明，內源tRNA重編程對全局基因表達及蛋白質翻譯均未產生顯著影響，共同證明了該策略較高的安全性。

為驗證新策略的治療潛力，研究團隊選取了TPP1、HEXA與NPC1三種基因，構建了共六種攜帶不同無義突變的HEK293T細胞模型。實驗結果表明，在通過引導編輯完成內源性sup-tRNA重編程后，TPP1和HEXA基因突變模型中，酶活性得到顯著恢復，恢復程度介于17%至70%之間；而NPC1基因突變模型中，全長蛋白的表達水平也出現明顯提升。此外，研究者在實現sup-tRNA穩定重編程的細胞系中，系統評估了該策略對ClinVar數據庫中14746種致病性無義突變（PTCs）的通讀能力。結果顯示，所有突變的平均通讀分數達到69%±30%，充分證明了該策略在廣譜遺傳背景下的有效性與普適性。為評估新策略在活體內的治療效果，研究團隊分別在攜帶TAG終止密碼子突變的GFP報告小鼠和IDUA基因突變的Hurler綜合征小鼠模型中開展了實驗。結果顯示，在GFP報告模型中，該策略可使約25%的GFP表達得以恢復；而在Hurler綜合征模型中，治療后IDUA酶活性恢復至正常水平的6%，并伴隨病理表型的顯著改善。上述結果共同證實了該策略在哺乳動物體內具有明確的治療潛力。

綜上所述，本研究提供了一種新的基因治療范式：從針對極少數患者的高度個體化方案，轉向了面向廣大無義突變攜帶者的通用型基因編輯策略。研究者以具有冗余特征的內源性tRNA為靶點，利用引導編輯系統的廣譜編輯能力，將其重編程為sup-tRNA，從而為攜帶不同類型無義突變的患者群體提供了相對統一的治療選擇。這一策略有望在保持良好耐受性的同時，實現對多種無義突變的通讀，并維持內源性tRNA的正常調控，從而避免外源過表達sup-tRNA對整體翻譯過程的干擾及其潛在的長期安全風險。

https://doi.org/10.1038/s41586-025-09732-2

制版人： 十一

參考文獻

1. Landrum, M. J. et al. ClinVar: public archive of relationships among sequence variation and human phenotype.Nucleic Acids Res. 42, D980–D985 (2014).

2. Albers, S. et al. Engineered tRNAs suppress nonsense mutations in cells and in vivo.Nature618, 842–848 (2023).

3. Wang, J. et al. AAV-delivered suppressor tRNA overcomes a nonsense mutation in mice.Nature604, 343–348 (2022).

4. Lant, J. T., Berg, M. D., Heinemann, I. U., Brandl, C. J. & O’Donoghue, P. Pathways to disease from natural variations in human cytoplasmic tRNAs.J. Biol. Chem.294, 5294–5308 (2019).

5. Berg, M. D. et al. Targeted sequencing reveals expanded genetic diversity of humantransfer RNAs.RNA Biol.16, 1574–1585 (2019).

6. Ding, W. et al. Rare codon recoding for efficient noncanonical amino acid incorporation in mammalian cells.Science384, 1134–1142 (2024).

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