揭秘 CHO 細胞：重組蛋白生產的 “功臣” 與 “難題”

摘要：中國倉鼠卵巢（CHO）細胞是生產重組治療性蛋白（RTPs）的核心工具，憑借懸浮培養(yǎng)、高密度生長及類人翻譯后修飾等優(yōu)勢，成為生物制藥工業(yè)的首選。但細胞克隆異質性和蛋白聚集兩大問題，嚴重影響重組蛋白的產量與質量。本文從 CHO 細胞克隆異質性的成因、蛋白聚集的瓶頸，以及對應的解決策略展開科普，帶你了解這一生物制藥領域的關鍵難題與最新突破。

一、CHO 細胞：生物制藥的 “明星工廠”

在生物制藥領域，重組治療性蛋白（RTPs）是當之無愧的 “頂流”，其中單克隆抗體藥物更是占據(jù)了全球生物藥市場的半壁江山。2021 年全球生物制藥市場規(guī)模達 3366 億美元，單克隆抗體藥物就貢獻了 2054 億美元，預計 2025 年還將攀升至 2921 億美元。

要生產這些珍貴的蛋白藥物，合適的 “細胞工廠” 至關重要。大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞都能用來生產蛋白，但哺乳動物細胞的翻譯后修飾（PTMs）與人類細胞高度相似，這讓它們成為生產重組治療性抗體的核心選擇 ——2018-2022 年新獲批的重組治療性抗體中，81% 都來自哺乳動物細胞。

而在眾多哺乳動物細胞里，CHO 細胞是絕對的 “明星選手”。它能實現(xiàn)懸浮、高密度、大規(guī)模培養(yǎng)（最大可達 12000 升），還能輕松整合并表達外源基因，生產出的蛋白修飾接近人類，且能抵抗人類病毒感染。如今 CHO 細胞的抗體產量已能達到 5.0 g/L，批次培養(yǎng)時甚至超 13.0 g/L，是工業(yè)生產重組治療性蛋白的主力軍。

但這位 “明星工廠” 并非完美無缺，細胞克隆異質性和產品聚集兩大問題，始終是制約其生產效率和產品質量的 “絆腳石”。

二、CHO 細胞克隆異質性：為何 “同廠不同產”？（一）細胞系開發(fā)中的隨機與靶向之爭

CHO 細胞系開發(fā)（CLD）是個復雜的過程，包括轉基因載體構建、轉染、穩(wěn)定細胞克隆篩選等多個步驟（見圖 1）。目前篩選細胞克隆的方法主要有有限稀釋、半固體培養(yǎng)基結合流式細胞術篩選等。

過去，生產重組蛋白主要靠隨機轉基因整合（RTI），也就是把目的基因隨機插到宿主細胞染色體上。這種方法操作簡單，也能篩選出高表達細胞克隆，是行業(yè)內的 “金標準”。但它完全靠運氣，不僅篩選過程耗時費力，還會導致細胞克隆高度異質，甚至出現(xiàn) DNA 雙鏈斷裂、點突變等問題。

為了改善這一情況，半靶向整合（STI）和位點特異性整合（SSI）技術應運而生。STI 借助轉座酶系統(tǒng)實現(xiàn)半靶向整合，能提升表達水平和穩(wěn)定性，縮短篩選時間，但整合拷貝數(shù)不可預測，仍存在克隆異質性；SSI 則能將基因插入預定位點，從根源上消除異質性，可卻面臨篩選難度大、表達量低的問題。三種整合方式的特點對比見表 1。

表 1 三種轉基因整合模式的對比

（二）細胞本身與轉錄沉默的 “推波助瀾”

CHO 細胞的染色體本就不穩(wěn)定，正常 CHO 細胞有 22 條染色體，而常用的 CHO-K1 只有 20 條，還存在缺失、易位等變異。長期培養(yǎng)后，高表達細胞克隆會出現(xiàn)基因型和表型漂移，導致產量和質量波動。

此外，轉錄沉默也是重要原因。DNA 甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳變化，會讓外源基因的表達逐漸沉默。比如 CMV、SV40 等常用啟動子含大量 CG 區(qū)域，容易被甲基化而失去活性，即便增加基因拷貝數(shù)，蛋白產量也可能下降。不過科學家發(fā)現(xiàn)，在載體中加入基質附著區(qū)（MAR）、通用染色質開放元件（UCOE）等元件，能有效緩解轉錄沉默，提升基因表達的穩(wěn)定性。

三、重組蛋白聚集：CHO 細胞生產的 “致命瓶頸”

即便解決了克隆異質性，蛋白聚集也會讓 CHO 細胞的 “生產成果” 大打折扣。蛋白聚集不僅會降低蛋白回收率、影響產品保質期，還可能引發(fā)人體免疫反應 ——10% 的聚集物就可能導致嚴重的免疫問題，甚至危及生命。

（一）蛋白聚集的內在原因

內質網 - 高爾基體加工效率不足CHO 細胞的內質網（ER）是蛋白折疊、修飾的 “車間”，高爾基體則負責蛋白的分揀和運輸。但內質網的加工能力有限，當大量重組蛋白需要折疊時，會出現(xiàn)錯誤折疊或部分折疊的肽鏈堆積。這些 “殘次品” 若超出內質網相關降解（ERAD）途徑的處理能力，就會引發(fā)未折疊蛋白反應，最終形成聚集。而且內質網到高爾基體的運輸是蛋白分泌的限速步驟，運輸延遲或載體受體不足，也會加劇聚集。

蛋白分子結構與表達分泌失衡蛋白的氨基酸序列、空間結構決定了它是否容易折疊錯誤。基因突變、翻譯錯誤、翻譯后修飾異常等，都會讓蛋白失去天然結構，暴露疏水區(qū)域，進而聚集。對于抗體來說，輕鏈（LC）和重鏈（HC）的表達比例失衡，或是信號肽選擇不當導致分泌效率低，也會造成抗體折疊錯誤、形成聚集。

內質網自噬功能障礙內質網自噬能清除未折疊蛋白，幫助正確折疊。研究發(fā)現(xiàn)，高聚集的雙特異性抗體細胞系中，多個自噬相關基因表達異常；而過表達 AKT1S1、ATG16L1 等自噬基因，能顯著減少抗體聚集。

表 2 重組蛋白聚集的胞內原因及解決策略

（二）外部環(huán)境的 “雪上加霜”

細胞培養(yǎng)環(huán)境也會影響蛋白聚集。溫度、pH、滲透壓、溶解氧等參數(shù)，以及培養(yǎng)基成分，都可能成為 “導火索”。比如酪氨酸是抗體表達的必需氨基酸，但高濃度會導致聚集；而海藻糖、脯氨酸等添加劑，能有效減少蛋白聚集。降低培養(yǎng)溫度、調整 pH 至 7.5、提高滲透壓等，也能在一定程度上緩解聚集問題（見表 3）。

表3 細胞培養(yǎng)過程中蛋白折疊、分泌與聚集的調控因素

四、未來展望：讓 CHO 細胞工廠更 “靠譜”

為了解決 CHO 細胞的兩大難題，科學家們正在不斷探索。比如將 CRISPR/Cas9 與轉座酶結合，實現(xiàn)轉基因的定點高效整合，兼顧低異質性和高表達量；通過基因編輯改造 CHO 細胞，過表達內質網分子伴侶、自噬相關基因，從細胞內部減少蛋白聚集；利用多組學和人工智能技術，解析 CHO 細胞的基因調控網絡，優(yōu)化培養(yǎng)工藝。

相信隨著這些技術的發(fā)展，CHO 細胞的 “短板” 將被不斷補齊，為生物制藥行業(yè)生產出更多高質量的重組蛋白藥物。

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