姜紅、王平、曹丹、徐洋、James. Qun Wang等應用多模態解析復發/難治DLBCL的單細胞圖譜

彌漫大 B 細胞淋巴瘤（ diffuse large B-cell lymphoma ， DLBCL ）是常見 的 侵襲性非霍奇金淋巴瘤，具有高度異質性和臨床預后差的特點。盡管 R-CHOP 方案是 DLBCL 的一線標準治療，但仍有超過三分之一的患者出現復發或對治療耐藥，復發 / 難治性 DLBCL 的總體預后極差。如何尋找有效的預測標志物、改善復發機制下的免疫抑制微環境，是臨床和科研急需解決的重大問題。

DLBCL 的復發與耐藥與其免疫抑制性微環境密切相關。大量研究發現，復發 / 難治性 DLBCL 患者往往伴隨免疫效應細胞功能低下，同時免疫抑制細胞顯著富集，導致抗腫瘤免疫被持續削弱。與此同時，惡性 B 細胞通過激活關鍵信號通路，進一步放大抑制性分子的表達，阻礙 T 細胞等免疫效應細胞的增殖與活化，從而形成持續的免疫抑制狀態。這一機制被認為是 DLBCL 復發或 耐藥的重要原因。然而，關于復發過程中免疫微環境如何被逐步重塑，仍缺乏系統性的解析 。

近日，四川大學華西醫院生物治療全國重點實驗室姜紅教授、王平副研究員與華西醫院曹丹教授，聯合浙江大學徐洋教授以及浙江大學愛丁堡大學聯合學院JamesQunWang教授等合作，在Chinese Medical Journal（中華醫學雜志英文版）發表了題為Multimodal profiling identifies CD4+CXCR5+PD-1–Tfhcells as prognostic and predictive biomarkers in diffuse large B-cell lymphoma的研究論文。

該研究綜合利用單細胞RNA測序、DNA測序、多重免疫組化（ mIHC ）、動物模型及深度學習技術，對彌漫大B細胞淋巴瘤（ DLBCL ）的腫瘤細胞與免疫微環境進行了系統性的多模態解析。研究首先繪制了初治與復發/難治DLBCL的單細胞圖譜，發現CD4?CXCR5?PD-1?濾泡輔助性T細胞（ Tfh1 ）在復發/難治性患者中顯著減少。基于此，研究提出CD4?CXCR5?PD-1? Tfh1細胞可作為DLBCL新的預后與預測生物標志物。此外，團隊還基于人工智能開發了mIHC圖像生成技術，為臨床高效檢測與個體化治療指導提供了潛在的新工具。

圖 1. a . 實驗流程概述 : 本研究從 68 例接受 R-CHOP 方案治療的 DLBCL 患者中篩選出 51 例納入分析。 b . DLBCL 單細胞圖譜 - 跨數據集整合的 UMAP 空間分布 ； c . 研究隊列 UMAP 注釋圖譜（標注主要細胞類型） 。

研究首先繪制了 初治 與復發 / 難治 DLBCL 的單細胞圖譜，發現 CD4?CXCR5?PD-1? 濾泡輔助性 T 細胞（ Tfh1 ） 在復發 / 難治性 DLBCL 中顯著缺失。進一步分析表明，這一細胞亞群的存在與良好預后和 R-CHOP 應答密切相關。機制研究揭示，復發腫瘤中的惡性 B 細胞可通過 激活 TNF-α/NF- κB 信號通路 抑制 Tfh1 細胞功能，從而導致免疫逃逸和疾病進展。

圖 2 . a . 基于 UMAP 的 DLBCL 腫瘤微環境 T/NK 細胞亞群空間分布 ； b . 基于 UMAP 的 DLBCL 腫瘤微環境中 T/NK 細胞亞群空間分布及樣本分組 ； c . DLBCL 腫瘤微環境中 CD4 ? T 細胞頻率的組間差異分析 。

臨床樣本驗證顯示， 腫瘤微環境中 高水平 Tfh1 細胞浸潤的患者具有更長的總體生存期，并對 R-CHOP 方案更敏感；而低水平 Tfh1 細胞的患者則更易復發，療效不佳。為解決臨床檢測難題，研究團隊還開發了一種基于生成對抗網絡（ GAN ）的圖像預測方法，可利用常規 DAPI 圖像預測 mIHC 結果，從而高效識別 Tfh1 細胞，提升了臨床應用可行性。

這些發現提出 CD4?CXCR5?PD-1? Tfh1 細胞 可作為 DLBCL 新的預后與預測生物標志物，同時，團隊開發的 AI 模擬 mIHC 技術，有望實現臨床高效檢測并指導個體化治療。

彌漫大 B 細胞淋巴瘤（ DLBCL ）是常見的侵襲性非霍奇金淋巴瘤，其臨床異質性極高，盡管 R-CHO 方案顯著改善了部分患者的預后，但仍有約 30 - 40% 的患者出現復發或難治性疾病，提示對 DLBCL 免疫逃逸機制的深入理解仍存在巨大需求。 DLBCL 微環境中， T 細胞耗竭及輔助性 T 細胞（ Tfh1 ）缺失被認為是腫瘤免疫逃逸的重要因素，但其分子和空間機制尚未系統闡明。基于課題組在腫瘤免疫微環境的 探索 ，我們提出 DLBCL 患者中 CD4?CXCR5?PD-1? Tfh1 細胞的缺失，可能通過調控 B 細胞和 CD8? T 細胞間的信號網絡，促進腫瘤的免疫抑制微環境形成，從而加速疾病復發。在實驗過程中，團隊面臨了多方面挑戰。例如，淋巴瘤組織中 沒有明顯的腫瘤區域和間質區域的區分， T 細胞亞群空間分布不均，導致多色免疫熒光（ mIHC ）和空間組學分析難以獲得高信噪比數據。為此，優化了組織切片固定與抗體復染流程，并 結合 單細胞及空間轉錄組分析，以保證 結論 的可重復性和可靠性。此外，我們結合流式細胞分析、體外共培養及機制實驗，驗證了 Tfh1 細胞缺失與 CD8?T 細胞耗竭及關鍵信號通路激活之間的因果關系。

本研究創新性： 1 ） 概念創新性 ：提出 Tfh1 缺失可作為 DLBCL 復發的預測因子，并揭示其免疫調控機制； 2 ） 研究系統性 ：整合空間組學、單細胞測序和功能驗證實驗，形成從機制到臨床相關性的完整證據鏈； 3 ） 臨床轉化價值 ：開發了一種基于生成對抗網絡（ GAN ）的圖像預測方法，可利用常規 DAPI 圖像預測 mIHC 結果。

當然，本研究仍存在局限性： 1 ）機制層面， Tfh1 缺失與特定信號通路的調控網絡仍需進一步解析； 2 ）模型系統方面，小鼠模型與人類 DLBCL 在免疫微環境上仍存在差異。針對這些問題，我們計劃通過構建人源化模型、開發患者來源淋巴瘤類器官系統等策略，深入探索臨床轉化潛力。

原文鏈接：https://journals.lww.com/cmj/fulltext/9900/multimodal_profiling_identifies_cd4_cxcr5_pd_1_.1750.aspx

專家點評

余巖 ，教授，博士生導師，四川大學生命科學學學院

姜紅 教授 團隊在彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）免疫微環境研究領域取得重要突破。該研究通過多模態分析技術，首次明確CD4?CXCR5?PD-1? Tfh 細胞作為DLBCL的預后與預測生物標志物，并創新性地開發了基于條件生成對抗網絡的智能病理診斷方法。研究團隊構建了端到端的Pyramid pix2pix-cGAN模型，能夠直接從DAPI染色圖像生成高質量的多重免疫組化（ mIHC ）圖像，顯著降低了傳統 mIHC 的技術門檻和資源消耗。該模型在驗證集中達到0.86的準確率和0.68的召回率，成功實現了CD4?Tfh1細胞的精準識別。相較于傳統細胞分類算法，這一方法突破了手動特征提取的局限，通過自適應監督塊匹配損失函數保證了像素級圖像生成質量。該技術的臨床轉化價值尤為突出，在資源有限地區，僅需常規DAPI染色即可獲得關鍵免疫細胞浸潤數據，為DLBCL的精準分療提供支持。未來結合多組學數據驗證，有望基于該工作構建全自動診斷系統，最終推動淋巴瘤精準診療體系的革新。

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