Nature Communications | 石偉等在新冠病毒刺突蛋白S2′位點切割后的影響研究方面取得進展

2019 年底首次發現的新冠病毒（SARS-CoV-2）引起COVID-19（新型冠狀病毒肺炎）大流行，并迅速演變成一場全球性的公共衛生危機。 SARS-CoV-2 是一種單股正鏈 RNA 病毒，其表面的刺突蛋白（spike，S）負責介導病毒的膜融合，也是疫苗設計的主要靶標。SARS-CoV-2通過其包膜脂質雙層與宿主細胞膜發生融合，從而啟動對宿主細胞的感染。為克服膜融合過程中存在的顯著動力學能壘，S蛋白會從一種亞穩態的融合前構象重折疊為能量更低、更加穩定的融合后構象。S 蛋白在合成后首先在一個蛋白酶切割位點被切成 S1 和 S2 兩個亞基；但在膜融合發生之前，推測S蛋白還需要在第二個切割位點（即S2′位點）被一種跨膜絲氨酸蛋白酶TMPRSS2進一步切割，S2′位點的切割對于病毒膜融合和病毒感染入侵非常重要，但其確切的影響機制尚不清楚。

近期，來自哈佛醫學院/波士頓兒童醫院的Bing Chen課題組（共同一作、共同通訊石偉）在《自然·通訊》（Nature Communications）上在線發表了題為“Effect of the S2′ site cleavage on SARS-CoV-2 spike”的研究論文。該研究報道了S2′位點切割后的 S2 片段的冷凍電鏡結構，該結構很可能代表一種晚期膜融合中間態構象；此外，功能實驗表明S2′ 位點的切割可增強膜融合過程，其作用機制可能是通過穩定膜融合中間態來實現的。這些研究結果加深了對 SARS-CoV-2入侵宿主細胞機制的理解，并為針對致病性冠狀病毒的干預策略提供理論依據。

為評估S2′位點切割對結構的影響，建立了一套制備 S2′ 位點被完全切割的 S2 片段（S2′片段）的方法。在制備 S2′片段時，首先將穩定表達 C 端帶有 Strep 標簽的全長S蛋白的細胞與可溶性 ACE2蛋白 孵育，隨后用胰蛋白酶處理，通過親和層析進行純化，獲得了完整的 S2′片段。該片段的完整性通過 N 端測序以及 Western blot 檢測 C 端標簽得以確認。純化后的S2′片段呈現出類似融合后構象的特征性棒狀形態，既可以單個三聚體形式存在，也可以形成由 2 或 3 個三聚體組成的簇狀結構。

利用冷凍電鏡的方法，解析了分辨率大概為3.1 ? 的S2′片段三聚體結構。該結構類似融合后構象的S2蛋白三聚體，其核心結構由 HR1、HR2、CH 和 3H 螺旋組成（圖 1a、1b），與此前報道的融合后S蛋白結構幾乎完全一致。S1/S2-S2′小片段在S2′位點切割后已不再與S2其余部分形成共價連接（圖 1a），但該小片段仍然與三聚體緊密結合在一起。與此前發表的融合后 S2 結構相比，該結構最顯著的差異出現在包含膜相互作用片段的一端——即融合肽和跨膜區（圖 1c）。融合肽簇及其鄰近結構的局部三重對稱軸相對于三聚體其余部分的三重對稱軸傾斜約25°。有意思的是，三條 TM 螺旋及其 N 端相鄰的HR2片段呈側向伸展，而不是圍繞融合肽簇分布；其中來自三個亞基中兩個的S816-834片段進一步穩定了這種側向伸展。總體而言，該結構表明S2′位點切割并不顯著影響融合肽的位置，且S1/S2-S2′片段在切割后不會從三聚體中解離。 此外，還從同一數據以及另一個獨立數據中獲得了一個低分辨率的結構，顯示兩個S2′片段三聚體通過其融合肽的疏水相互作用形成二聚體（圖 2）。

圖1. 新冠病毒刺突蛋白 S2′片段在晚期膜融合中間態構象下的結構

圖2. S2′片段通過融合肽的疏水作用形成二聚體的密度圖及原子模型

此前，研究人員通過點突變對S蛋白的 S2′切割位點進行了研究，但這些突變對融合前三聚體穩定性的影響并未得到充分討論。該研究將S蛋白中的Arg815突變為所有其他可能的氨基酸，其中許多替換突變在不影響刺突蛋白表達水平、但會阻斷 TMPRSS2 或胰蛋白酶對S2′位點切割的情況下，仍然能夠高效支持細胞-細胞融合（圖 3a），表明Arg815 有助于穩定融合前構象，但涉及該殘基的S2′位點特異性切割并非膜融合所必需，而Arg815的突變都會完全消除 TMPRSS2 介導的膜融合增強效應（圖 3b），提示 TMPRSS2 對S2′位點的切割是增強細胞表面膜融合所必需的。當這些突變構建在病毒樣顆粒（VLP）體系中進行檢測時，TMPRSS2仍然能夠增強 VLP 的感染性（圖 3c）。其中，多種 S 蛋白突變體（R815F、R815L、R815H、R815Q 和 R815W）能夠高效地摻入 VLP，并表現出與野生型S蛋白相當的感染能力（圖 3c）。對于其余所有仍具有融合活性的突變體，不論S2′位點或者furin位點二者是否發生突變，其 VLP 感染性均表現出 TMPRSS2 依賴性的增強效應（圖 3c）。TMPRSS2 對 VLP 感染性的增強作用可能通過內吞體進入途徑實現，并不依賴于S2′位點的切割，與發生在細胞表面的膜融合過程形成鮮明對比。

圖3. S2′切割位點突變的影響

本研究加深了對 SARS-CoV-2 膜融合入侵過程的認識，并為防控致病性冠狀病毒的干預策略提供理論依據。

哈佛醫學院/波士頓兒童醫院的Wei Shi（石偉）、GM Jonaid和Md Golam Kibria為本文共同第一作者。哈佛醫學院/波士頓兒童醫院的Bing Chen和Wei Shi（石偉）為本文共同通訊作者。

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