Mol?Ther｜一步式、高效率大片段定點(diǎn)整合

嵌合抗原受體 T 細(xì)胞（ CAR-T ）療法，被認(rèn)為是近二十年來腫瘤治療領(lǐng)域最具突破性的技術(shù)之一。自首批 CAR-T 產(chǎn)品獲批以來，該療法在多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤中取得了令人矚目的臨床效果，部分患者甚至實現(xiàn)了長期無病生存。然而，隨著 CAR-T 從 “ 突破性治療 ” 逐步走向更廣泛的臨床應(yīng)用，其背后的 細(xì)胞工程制造方式 正受到越來越多關(guān)注。事實上，當(dāng)前 CAR-T 療效差異、生產(chǎn)成本高、個體間不穩(wěn)定等問題，很大程度上并非源于 CAR 設(shè)計本身，而是與 CAR 基因如何被導(dǎo)入并表達(dá) 密切相關(guān)。目前，幾乎所有已上市或進(jìn)入后期臨床階段的 CAR-T 產(chǎn)品，仍采用慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的隨機(jī)整合策略，將 CAR 基因?qū)牖颊邅碓吹? T 細(xì)胞中。這一路線之所以被廣泛采用，主要源于其技術(shù)成熟、操作穩(wěn)定以及產(chǎn)業(yè)鏈配套完善。

然而，這種 “ 歷史最優(yōu)解 ” 正在逐漸顯露出其內(nèi)在局限：首先，插入位點(diǎn)不可控 。病毒載體在基因組中的隨機(jī)整合，可能干擾內(nèi)源基因或調(diào)控元件，存在潛在的基因毒性和致瘤風(fēng)險。盡管臨床上此類事件發(fā)生概率較低，但在長期、大規(guī)模應(yīng)用背景下，安全性問題始終無法徹底回避。其次， CAR 表達(dá)高度異質(zhì) 。不同細(xì)胞中 CAR 的插入位置和拷貝數(shù)不同，導(dǎo)致 CAR 表達(dá)水平差異顯著。這種不均一性不僅影響殺傷效果的一致性，也增加了治療結(jié)果的不可預(yù)測性。第三，隨機(jī)整合常伴隨 持續(xù)、高水平的 CAR 表達(dá) ，容易引發(fā) T 細(xì)胞在無抗原條件下的 “ 自發(fā)激活 ” ，進(jìn)而加速功能耗竭，縮短 CAR-T 的體內(nèi)持久性。隨著通用型 CAR-T 、多基因編輯需求的不斷增加，這些問題正在成為限制 CAR-T 進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸。因此，一個看似簡單卻始終未被真正解決的問題逐漸浮出水面：是否能夠在原代免疫細(xì)胞中，高效、精準(zhǔn)、穩(wěn)定地將一個功能完整的 CAR 基因定點(diǎn)敲入到預(yù)定基因位點(diǎn)？

近日，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)吳森、杜旭光團(tuán)隊，北京中醫(yī)藥大學(xué)王建勛團(tuán)隊，與諾貝爾獎得主Mario R. Capecchi教授團(tuán)隊合作，在Molecular Therapy發(fā)表研究論文

BASIC Enables Selection-Free Efficient Knock-In of Large DNA in Primary Human T Cells

與以往工作不同， BASIC 并非在單一技術(shù)環(huán)節(jié) “ 修修補(bǔ)補(bǔ) ” ，而是 從遞送邏輯和工藝流程層面，重新設(shè)計了 CAR-T 的構(gòu)建方式 。該平臺具有幾個鮮明特點(diǎn)：全流程 不依賴電轉(zhuǎn) ，避免細(xì)胞損傷；無需藥物篩選 ，大幅簡化制備流程；完全避免隨機(jī)整合；可在一步操作中同時完成 基因敲除與 CAR 基因敲入 。最終，在原代人 T 細(xì)胞中實現(xiàn)了 超過 85% 的 CAR 定點(diǎn)整合效率 ， 代表了當(dāng)前該領(lǐng)域中報道的最高水平之一 。

類病毒顆粒（ Virus-Like Particles ， VLP ）因其僅保留病毒外殼、完全不攜帶病毒基因組，被認(rèn)為是遞送 CRISPR-Cas9 等基因編輯工具的理想載體。然而， VLP 在原代免疫細(xì)胞中的應(yīng)用長期受限，其核心瓶頸并非 Cas9 本身，而是 遞送效率不足 。研究團(tuán)隊將突破口放在了一個常被忽視卻至關(guān)重要的因素上 —— 包膜蛋白的選擇 。傳統(tǒng) VLP 多采用 VSV-G 包膜，該包膜在多種細(xì)胞類型中表現(xiàn)良好，但在原代 T 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞中的遞送效率并不理想。研究人員系統(tǒng)評估了來源于 狒狒 內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（ BaEV ）的包膜蛋白，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計出一個截短變體 BaEVshort 。這一看似 “ 結(jié)構(gòu)上的微調(diào) ” ，卻帶來了顯著改變：VLP 的包裝滴度顯著提高；Cas9–sgRNA 復(fù)合物在原代 T 細(xì)胞中的遞送效率大幅提升；多個基因位點(diǎn)的敲除效率可穩(wěn)定超過 90% ；細(xì)胞活性與增殖能力幾乎不受影響。更重要的是， BaEVshort-VLP 完全不攜帶任何逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組 ，從源頭規(guī)避了隨機(jī)整合風(fēng)險。至此， BASIC 平臺解決了第一個核心問題： 如何在原代免疫細(xì)胞中高效而溫和地遞送基因編輯工具。

解決 Cas9 的遞送只是第一步， 大片段基因的精準(zhǔn)敲入 仍是另一道難關(guān)。此前有研究嘗試使用非整合型慢病毒（ NILV ）作為供體模板，但在原代 T 細(xì)胞中，由于供體 DNA 拷貝數(shù)有限， HDR 效率始終難以提升。在 BASIC 平臺中，研究團(tuán)隊選擇 AAV6 作為同源重組供體載體。 AAV6 具有多項關(guān)鍵優(yōu)勢：其以單鏈 DNA 形式存在，天然適配 HDR 修復(fù)路徑；可在細(xì)胞內(nèi)形成高拷貝供體模板；并已在多項臨床研究中驗證了良好的安全性。在 BASIC 體系中：BaEVshort-VLP 負(fù)責(zé)遞送 Cas9 RNP ；AAV6 同步遞送 CAR 供體模板。二者一次感染，即可完成 TRAC 位點(diǎn)敲除與 CAR 的定點(diǎn)敲入 。

這一設(shè)計避免了傳統(tǒng) “ 電轉(zhuǎn) + AAV” 方案中常見的細(xì)胞損傷和流程復(fù)雜問題，真正實現(xiàn)了一步式操作。

在 TRAC 位點(diǎn)敲入 CD19-CAR 的經(jīng)典模型中， BASIC 在原代人 T 細(xì)胞中實現(xiàn)了：>94% 的 TRAC 基因敲除效率 ；最高超過 85% 的 CAR 定點(diǎn)敲入效率； CAR 表達(dá)嚴(yán)格限制在 CD3 ? 細(xì)胞群 ；CD4 ? 與 CD8 ? 亞群中 CAR 表達(dá)高度一致；整個流程中 細(xì)胞活性始終保持在 90% 以上 。值得強(qiáng)調(diào)的是，這一效率是在 完全不使用藥物篩選、不進(jìn)行電轉(zhuǎn)操作 的條件下獲得的，顯著降低了制備復(fù)雜度。

在系統(tǒng)的功能評估中， BASIC 工程化的 CAR-T 細(xì)胞表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢：在體外殺傷實驗中，其殺傷速度更快、效率更高，并可在多輪腫瘤刺激后持續(xù)保持功能；效應(yīng)因子如 IL-2 、 IFN-γ 、 TNF-α 和 Granzyme B 的分泌水平顯著提高；同時， PD-1 、 TIM-3 等耗竭標(biāo)志物明顯降低。在小鼠白血病模型中， BASIC 構(gòu)建的 CAR-T 細(xì)胞表現(xiàn)出更持久的腫瘤清除能力，并顯著延長動物生存期。其內(nèi)在機(jī)制在于： CAR 被精準(zhǔn)敲入 TRAC 位點(diǎn)，使其表達(dá)受內(nèi)源性 TCR 調(diào)控，僅在識別抗原時被激活，從而避免了隨機(jī)整合導(dǎo)致的持續(xù)高表達(dá)和 “ 自發(fā)激活 ” 。

隨著 CAR-T 技術(shù)向 “ 現(xiàn)貨型 ” 和 “ 通用型 ” 方向發(fā)展，多基因編輯已成為不可回避的需求。 BASIC 平臺在 T 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞中均可高效支持 TRAC 、 B2M 、 PD-1 、 CTLA4 等多個位點(diǎn)的聯(lián)合敲除，并同時進(jìn)行 CAR 的精準(zhǔn)敲入，且在多供體實驗中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。這一特性，使 BASIC 成為構(gòu)建低免疫原性、高一致性通用免疫細(xì)胞產(chǎn)品的重要技術(shù)基礎(chǔ)。

隨著 VLP 規(guī)?；a(chǎn)體系的逐步成熟， BASIC 有望發(fā)展為一種 通用的精準(zhǔn)免疫細(xì)胞工程平臺 。該體系還可進(jìn)一步與 Base Editing 、 Prime Editing 等新一代基因編輯技術(shù)結(jié)合，在減少雙鏈斷裂風(fēng)險的同時，拓展更廣泛的應(yīng)用場景。

從 CAR-T 到 CAR-NK ，從自體治療到通用型細(xì)胞產(chǎn)品， BASIC 提供了一條 更安全、更可控、更具工程化潛力的技術(shù)路徑 ，為下一代細(xì)胞治療的發(fā)展奠定了堅實基礎(chǔ)。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2025.12.064

制版人：十一

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