Cell?|?Jason McLellan 團隊解析安第斯病毒糖蛋白的原位高分辨率結構

ANDV 是一種人感染致死率高達40%的新世界漢坦病毒（New World Hantavirus es, NWHs），其自然宿主主要為為嚙齒類動物。依據其宿主分布地理位置， 漢坦病毒被劃分為舊世界漢坦病毒（ Old World Hantavirus es , OHWs ）和新世界漢坦病毒【1】。 OWHs 主要分布于亞洲，歐洲和非洲，其中中國是主要流行地區之一，每年感染人數平均在11000人左右【2】。人體感染 OWHs 后會產生腎出血熱綜合征（ Hantavirus hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS ），其致死率可達12%。 NHWs 主要分布于南美洲和北美洲，人感染 NHWs 后會產生漢坦病毒綜合癥（ Hantavirus pulmonary syndrome, HPS ），其感染致致死率可高達60%【1】。人體主要通過吸入霧化的感染的嚙齒類動物分泌物而感染，但 ANDV 可以直接通過親密接觸進行人際傳播【3,4】。目前，盡管中國和韓國批準了基于滅活漢坦病毒顆粒疫苗的使，但滅活病毒疫苗通常存在免疫原性較低且誘導長期免疫效應不足以及無法誘導細胞免疫等問題。此外，世界上尚無通過 WHO 或美國 NIH 審核的漢坦病毒疫苗上市。因此， ANDV 對人類健康構成重大挑戰。

與其他漢坦病毒類似， ANDV 屬于布尼亞病毒綱【5】，是一種分段反義 RNA 包膜病毒。這意味著其基因組是三段分段的反義 RNA, 被包裹在脂雙層膜里。依據其基因組大小， ANDV 基因組被命名為large (L), Medium (M), small(S) ，其中M段編碼2 種 病毒糖蛋白， Gn 和 Gc 。在宿主細胞中翻譯時， Gn 和 Gc 會首先形成異源二聚體，然后異源二聚體聚合形成四聚體，四聚體最終相互作用在囊膜表面形成格柵狀結構（lattice）并促進病毒自組裝與出芽。在現有的四聚體和格柵模型中， Gn 排列在內側介導四聚體組裝，而 Gc 排列在側邊，介導四聚體間的相互作用【6,7】。在入侵宿主細胞時， Gn 負責和受體結合，介導病毒內吞；當病毒顆粒被內吞進入內體（endosome）后，受內體內逐漸降低的p H 刺激， ANDV 糖蛋白網狀結構解體，釋放融合蛋白單體 Gc, 其在低p H 條件下會進行不可逆的三聚化，形成融合后蛋白三聚體，并驅動病毒脂雙層膜與內體細胞器膜融合，從而將其基因組 RNA 釋放到宿主細胞細胞質中，進行復制，轉錄和翻譯，最后組裝子代病毒。

盡管漢坦病毒所造成的巨大威脅，但我們依然沒有漢坦病毒顆粒的原位高清結構，對 ANDV 的自組裝機制以及病毒顆粒如何響應內體低 pH 刺激也知之甚少。這主要受限于漢坦病毒的 BSL3 (Biosafty Level 3) 生物安全操作環境要求。此外，由于漢坦病毒顆粒的多形 (pleomorphic) 特征， 傳統的冷凍電鏡單顆粒分析技術（ S ingle -particle cryo-EM ）無法應用于具有這一特征的病毒，目前唯一的方案是冷凍電鏡電子斷層三維重構（cry o-electron tomography, cryo-ET ）和亞斷層平均技術（sub tomogram averaging ）。但該方案對軟件和硬件有較高要求，且利用該方案獲得近原子分辨率尺度的結構具有較大難度。最后，抗體介導的體液免疫在抗漢坦病毒感染過程中發揮了重要作用，但傳統的基于 X -射線分析（ X-ray crystallography ）和可溶性蛋白 (soluble protein) 的結構表征策略無法快速地獲得抗原表位信息，也無法獲得抗體結合對漢坦病毒表面格柵結構的動態影響信息，因此極大地限制了基于結構的疫苗設計策略的應用，阻礙了新型高效疫苗的開發工作。

2026年2月27日，美國德克薩斯大學奧斯汀校區的 Jason McLellan 教授團隊 ( 郭魯強博士獨立一作 ) 在 C ell 雜志發表了題為 High-resolution in situ structures of hantavirus glycoprotein tetramers 的研究論文，系統性的解決并回答上述問題。團隊首先使用cryo -EM 對基于重組水皰性口炎病毒的假 ANDV 病毒（ recombinant vesicular stomatitis virus-based ANDV pseudo-virus,rVSV-ANDV）進行成像，發現 ANDV 糖蛋白主要分布于子彈狀病毒顆粒的兩端。而后，團隊利用e VLP （ EPM+EABR ）標簽 【 8 】 ，為高危病毒建立了一套完整的基于病毒樣顆粒（ VLP ）的新型冷凍電鏡單顆粒分析體系。利用該體系，研究團隊獲得了 ANDV 四聚體以及二聚化的四聚體（dimer of tetramers） 的原位高分辨率結構，揭示了 ANDV 病毒顆粒的組裝、穩定以及低 pH 響應的分子機制，表征了廣譜漢坦病毒抗體 ADI-65534 中和病毒感染的分子機理。最后，團隊探索了基于新型自擴增 RNA （ repRNA ）平臺 【 9 】 的漢坦病毒疫苗的開發潛力 。

為研究 ANDV 的原位高清結構，同時避開病毒的 BSL3 要求，研究團隊首先利用cryo -EM 對r VSV-ANDV 進行成像 , 驚訝地發現 ANDV 糖蛋白主要分布于子彈狀的 VSV 病毒顆粒的兩端， 與野生型 VSV 糖蛋白的分布形成鮮明對比【10】。研究團隊進一步研究了r VSV-SARS-CoV-2 和r VSV-CCHFV 的糖蛋白分布情況 , 發現 SARS-CoV-2 S 糖蛋白相對均勻地分布于子彈狀病毒顆粒的表面，而 CCHFV 糖蛋白類似地分布于子彈狀病毒顆粒的兩端。這一發現與報道的其他的基于 VSV 假病毒糖蛋白均勻分布的觀察形成鮮明對比， 對基于 VSV 的布尼亞病毒的疫苗開發以及效用評價具有重要的指導意義。

在cryo -EM 成像過程中，研究團隊注意到樣品中含有一些表面覆蓋高密度 ANDV 糖蛋白的 VLP s (ANDV-VLPs) 。因為其表面網狀結構更貼近真實病毒顆粒的狀態且ANDV 糖蛋白密度遠高于r VSV-ANDV ，因此，研究團隊更換研究目標為 ANDV-VLPs 。通過多輪測試，研究團隊最終發現，相對于野生型ANDV 構建， 將 eVLP 標簽整合至 Gc 胞內段，可以提升 VLPs 產量至30倍左右 。而后 , 為獲得近原子分子分辨率尺度的ANDV糖蛋白的原位結構，研究團隊經系統性優化傳統的單顆粒冷凍電鏡分析流程的關鍵步驟，包括蛋白顆粒挑選方案（particle picking stra tegies ） ， 蛋白顆粒提取大小（extraction box size ）以及中心再聚焦（re centering ）策略 , 最終 建立了一套完整的適用于pl eomorphic 病毒顆粒的原位高分辨結構的電鏡數據處理流程 。

基于這一流程，研究團隊首先解析了分辨率達2.35 ? 的 ANDV 糖蛋白 Gn-Gc 異源四聚體庫倫電勢圖（co ulomb potential map ），然后建立了除胞內段外的 Gn-Gc 四聚體全原子模型。基于此，團隊提出了 ANDV 糖蛋白四聚體的組裝機制，即 ANDV 糖蛋白四聚體主要由 Gn1-G c 1, Gn1-Gn2 以及 Gn 2 -Gn 2 三個界面主導，且水分子在穩定四聚體相互作用過程中發揮了重要作用 。為獲得格柵結構的組裝機制，研究團隊聚焦于dimer of tetramers, 重新提取蛋白顆粒。通過類似的數據處理流程，獲 得 dimer of tramers 三種密切相關的構象，即構象 I, II, II 。三種構象的分辨率分別為3.2 ? ，3.4 ? ， 3.4 ? 。這三種構象代表了四聚體相對于二聚化界面在脂雙層中不同的彎曲狀態 。通過仔細分析三種構象 , 團隊發現d imer of tetramers 主要由 Gc 的二聚化介導四聚體的聚合 , 與之前的報道一致 【 11 】 。但細究其 Gc 相互作用機制 , 團隊發現 Gc 二聚體原位結構缺少之前晶體結構中觀察到的多個二聚體間氫鍵，因此該弱相互作用界面奠定了三個彎曲構象的出現并解釋了 ANDV 病毒顆粒的 pleomorphic 的分子機理。同時 , 團隊意識到，在 dimer of tetramers 中，四聚體相對彼此是傾斜的 , 因此 , 如果這種狀態代表了一種能量最低的狀態的話， 那么就為 ANDV 糖蛋白自組裝病毒顆粒提供了合理解釋。

此外，團隊還發現 , 在幾乎所有參與形成 ANDV 糖蛋白四聚體以及dimer of tetramers 的關鍵界面中均有一個或多個組氨酸，并臨近帶正電的氨基酸聚集區或者與其他組氨酸相互作用 。因此，當p H 降低時 , 組氨酸質子化 , 會與正電的氨基酸相互排斥 , 由此擾亂關鍵相互作用界面 , 驅動格柵解體 , 四聚體分離 , 從而釋放融合蛋白 Gc 單體 , 為其不可逆的三聚化創造條件。因而原位結構模型為 ANDV 糖蛋白低 pH 響應提供了合理的分子機制。

為驗證建立的電鏡數據體系的可用于抗原表位的表征，研究團隊選擇經過親和力成熟優化的廣譜漢坦病毒抗體 ADI-65534 。通過共孵育抗體結合片段 (Fragment a ntigen binding, Fab) 與 ANDV-VLPs 以及類似的數據處理流程，團隊獲得了3.3 ? 的 ANDV-VLPs-65534 Fab 的原位四聚體結構以及6 . 8 ? 的 dimer of tetramer s結構。 ANDV-VLPs-65534 Fab 的原位四聚體結構解釋了ADI-65534相對其前代抗體高親和力的分子機制【12】, 而當嘗試匹配 ANDV-VLPs-65534 Fab 的原位四聚體結構至d imer of tetramer s 庫倫電勢圖中時，則顯示 65534- Ab 只能結合彎曲度最大的構象 III ，因而揭示了抗體結合對格柵結構的動態影響。此外，當等距放置Fc并測量抗體結晶片段（ Fc ）與 Fab 末端氨基酸殘基的距離時，團隊發現 全長 IgG 1難以交聯鄰近四聚體 ，因此推翻了之前發表的65534- IgG1 交聯鄰近四聚體的假設。

最后，為探索 ANDV-VLPs 作為疫苗的潛力，研究團隊使用自擴增 RNA (repRNA)【9】作為編碼遞送平臺，通過免疫小鼠來檢測體液和細胞免疫響應。研究發現，在10 ug的遞送量下，相比野生型 ANDV 構建 ( re pRNA-ANDV-WT) , 帶有突變和e VLP 標簽的構建（re pRNA-ANDV-DM-eVL P）可以最大化的刺激總IgG抗體響應，但中和抗體誘導量和T細胞免疫水平誘導上則無顯著差異 。該現象與觀察到的引入eVLP可顯著提升VLP表達量以及報道的基于e VLP 和 2 ug傳統mR NA 的 SARS-CoV-2 S 糖蛋白可顯著提升總抗體量以及中和抗體量【8】的結果相沖突，因此尚需更多研究來解釋其差異。

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(26)00117-0

制版人： 十一

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