【前沿&進(jìn)展】復(fù)旦張榮團(tuán)隊(duì)建立裂谷熱病毒單輪感染顆粒包裝系統(tǒng)并應(yīng)用于抗病毒藥物篩選

裂谷熱病毒（Rift Valley fever virus, RVFV）是一種可通過(guò)蚊媒傳播的高致病性人畜共患病原體，主要流行于非洲地區(qū)，致死率可達(dá)10%，并存在向其他地區(qū)擴(kuò)散的潛在風(fēng)險(xiǎn)。由于RVFV屬于生物安全三級(jí)（BSL-3）病原體，其高危險(xiǎn)性嚴(yán)重限制了相關(guān)基礎(chǔ)研究及抗病毒策略的開(kāi)發(fā)。目前，針對(duì)該病毒仍缺乏獲批的特效藥物和疫苗。

近日，復(fù)旦大學(xué)張榮團(tuán)隊(duì)在《Virologica Sinica》發(fā)表了題為“Single-cycle Rift Valley fever virus particles from stable replicon cells enable discovery of antiviral CNX-1351 for multiple RNA viruses”的研究論文。該研究成功構(gòu)建了可穩(wěn)定傳代的RVFV復(fù)制子細(xì)胞系，并在此基礎(chǔ)上建立了高效包裝單輪感染病毒樣顆粒（Virus Replicon Particles, VRPs）的系統(tǒng)。利用這一系統(tǒng)，研究團(tuán)隊(duì)篩選出具有廣譜抗RNA病毒活性的化合物CNX-1351，為抗病毒藥物研發(fā)等提供了新的高效平臺(tái)與策略。

研究主要亮點(diǎn)包括：

• 安全穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)：成功構(gòu)建可穩(wěn)定傳代的RVFV復(fù)制子細(xì)胞系（BHK-MP-12-Rep），包裝出的病毒顆粒僅能完成單輪感染，無(wú)法繼續(xù)擴(kuò)散，顯著降低了生物安全風(fēng)險(xiǎn)。

• 靈活通用的平臺(tái)設(shè)計(jì)：該系統(tǒng)可兼容不同毒株的糖蛋白（如MP-12疫苗株及ZH548野毒株等），便于研究病毒進(jìn)入機(jī)制、疫苗效價(jià)評(píng)估和中和抗體評(píng)價(jià)。

• 高效藥物篩選應(yīng)用：利用該單輪感染系統(tǒng)對(duì)3185種化合物進(jìn)行高通量篩選，發(fā)現(xiàn)CNX-1351不僅能有效抑制RVFV，還對(duì)發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）、寨卡病毒（ZIKV）等多種RNA病毒具有抑制作用。在高通量藥物篩選、病毒入胞與復(fù)制過(guò)程的藥效評(píng)價(jià)等提供了實(shí)用的工具。

復(fù)制子細(xì)胞系及單輪感染病毒顆粒的構(gòu)建

研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)分子生物學(xué)方法對(duì)RVFV MP-12疫苗株基因組進(jìn)行改造：剔除M節(jié)段，并在S節(jié)段中使用“mGreenLantern綠色熒光蛋白-P2A-嘌呤霉素抗性基因”替換非結(jié)構(gòu)蛋白NSs。隨后，在表達(dá)T7 RNA聚合酶的BHK-21細(xì)胞中，借助輔助質(zhì)粒提供病毒糖蛋白（Gn/Gc），成功包裝出單輪感染性復(fù)制子顆粒（VRPs）。感染野生型BHK-21細(xì)胞后，經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得可穩(wěn)定攜帶L和S節(jié)段的復(fù)制子細(xì)胞系。該細(xì)胞系不僅可用于病毒復(fù)制機(jī)制研究，也為抗病毒藥物的篩選提供了可靠工具。

在此基礎(chǔ)上，通過(guò)在復(fù)制子細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)Gn/Gc的質(zhì)粒，可高效包裝出病毒滴度穩(wěn)定在>10? IU/mL的單輪感染顆粒，完全滿(mǎn)足常規(guī)實(shí)驗(yàn)需求。連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了該系統(tǒng)的安全性與單輪感染特性。此外，通過(guò)替換不同來(lái)源的糖蛋白，可靈活制備嵌合型單輪感染顆粒，擴(kuò)展了該系統(tǒng)在交叉毒株研究中的應(yīng)用潛力（圖1）。

圖1. 復(fù)制子細(xì)胞系及單輪感染病毒顆粒的構(gòu)建

基于單輪感染顆粒的抗病毒藥物篩選

研究人員在Huh-7細(xì)胞中預(yù)處理10 μM濃度的化合物庫(kù)，之后以0.5 MOI的RVFV單輪感染顆粒侵染24小時(shí)，并利用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)分析病毒感染率與細(xì)胞毒性。從3185種化合物中初步篩選出10種候選分子，經(jīng)進(jìn)一步驗(yàn)證確定CNX-1351和鹽酸石蒜堿（Lycorine hydrochloride）具有顯著抗病毒活性與較高安全性（圖2）。

其中，CNX-1351此前并未有抗病毒相關(guān)報(bào)道，該化合物原作為PI3Kα亞型的共價(jià)抑制劑用于抗癌藥物研發(fā)。通過(guò)時(shí)間加入實(shí)驗(yàn)和布尼亞病毒微型基因組系統(tǒng)分析，研究團(tuán)隊(duì)證實(shí)CNX-1351主要作用于病毒復(fù)制階段。

圖2.基于單輪感染顆粒的抗病毒藥物篩選

值得注意的是，CNX-1351表現(xiàn)出廣譜抗RNA病毒活性，對(duì)裂谷熱病毒、拉克羅絲病毒（LACV）、發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒、寨卡病毒和基孔肯雅病毒均呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性抑制效果。機(jī)制研究表明，該化合物可顯著影響PI3K–Akt信號(hào)通路下游基因表達(dá)。使用另一PI3K通路抑制劑LY294002也能模擬其抗病毒表型，進(jìn)一步說(shuō)明調(diào)控宿主PI3K–Akt通路可能是應(yīng)對(duì)多種RNA病毒的有效策略。

該項(xiàng)研究不僅為RVFV基礎(chǔ)研究提供了安全、穩(wěn)定且操作簡(jiǎn)便的平臺(tái)系統(tǒng)，也揭示了一條通過(guò)靶向宿主信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)廣譜抗病毒的新途徑。這一系統(tǒng)還有望應(yīng)用于病毒檢測(cè)、疫苗研發(fā)與中和抗體評(píng)價(jià)等領(lǐng)域，為未來(lái)新發(fā)突發(fā)病毒疫情的防控提供重要的技術(shù)支撐。

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