福建農(nóng)林大學(xué)聯(lián)合福建省農(nóng)科院組裝龍眼主栽品種‘石硤’高質(zhì)量基因組，解析開花機(jī)制

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是中國熱帶與亞熱帶地區(qū)的重要特色果樹，具有逾兩千年的栽培歷史。其果實(shí)香甜多汁、營養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛，在我國熱帶果樹產(chǎn)業(yè)中占據(jù)著舉足輕重的地位。近年來，隨著氯酸鉀（KClO?）誘導(dǎo)反季節(jié)開花技術(shù)的廣泛應(yīng)用，龍眼在熱帶地區(qū)可實(shí)現(xiàn)全年開花結(jié)果，推動(dòng)產(chǎn)業(yè)從季節(jié)性栽培向周年化生產(chǎn)轉(zhuǎn)型，實(shí)現(xiàn)了跨越式發(fā)展。然而，龍眼的基因組研究相對(duì)滯后，主栽品種的遺傳信息尚未解析，這在一定程度上制約了開花調(diào)控機(jī)制的深入闡明與分子育種的精準(zhǔn)推進(jìn)。

近日，福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院明瑞光團(tuán)隊(duì)聯(lián)合福建省農(nóng)科院果樹所鄭少泉團(tuán)隊(duì)、華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院李建國團(tuán)隊(duì)在Plant Biotechnology Journal雜志在線發(fā)表題為Improved longan genome assembly reveals insights into flowering mechanisms的研究論文。該研究完成了龍眼主栽品種‘石硤’的高質(zhì)量基因組組裝，并系統(tǒng)解析了自然開花與KClO?誘導(dǎo)開花的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

研究采用三代HiFi測(cè)序與Hi-C技術(shù)，成功組裝441.5 Mb的‘石硤’基因組，并精確掛載至15條染色體。基因組Contig N50達(dá)28.1 Mb，僅存在3處缺口，鑒定出26個(gè)端粒和15個(gè)著絲粒，其中11條染色體達(dá)到端粒到端粒（T2T）水平。BUSCO評(píng)估的完整性指數(shù)為98.0%，LAI評(píng)估指數(shù)為21.2，QV值達(dá)到68.1。注釋到29,325個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，96.4%的基因得到了功能注釋。這是迄今為止連續(xù)性、完整性和準(zhǔn)確性最高的龍眼基因組圖譜，為精確基因定位和結(jié)構(gòu)變異分析奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

演化分析表明，龍眼與無患子科的荔枝、紅毛丹、無患子、文冠果存在密切的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和高度的共線性。但染色體融合與分裂事件使得染色體數(shù)在14 – 16條之間不一，而重復(fù)序列的變異導(dǎo)致基因組大小的差異（328.0 – 489.2 Mb）。通過龍眼和最相近的荔枝比較基因組分析，鑒定出486個(gè)龍眼特有基因家族（包含3,522個(gè)基因）以及3,206個(gè)無法比對(duì)到荔枝的特有基因，這些基因顯著富集于病原防御、谷胱甘肽代謝與糖代謝通路。五個(gè)物種的NBS基因鑒定發(fā)現(xiàn)龍眼中NBS基因數(shù)量顯著高于其他物種，且主要聚集在第2、3與5號(hào)染色體上。自龍眼與荔枝分化（約11.5 Mya）以來，龍眼發(fā)生了857個(gè)基因家族擴(kuò)張和1,587個(gè)基因家族收縮。擴(kuò)張家族中包括28個(gè)NBS型抗病基因，以及27個(gè)黃酮/黃酮醇生物合成相關(guān)基因。后者在自然開花與 KClO? 誘導(dǎo)的花芽中呈現(xiàn)較高表達(dá)，提示其可能在開花過程與次生代謝調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

圖1 龍眼品種‘石硤’的基因組結(jié)構(gòu)特征及系統(tǒng)發(fā)育和核型演化

結(jié)構(gòu)變異分析顯示，龍眼與荔枝的基因組共線性僅為43.6%，并存在大規(guī)模結(jié)構(gòu)變異：倒位（INV，約55.4 Mb）、重復(fù)（DUP，約9.6 Mb）與易位（TRANS，約3.0 Mb）。這些結(jié)構(gòu)變異區(qū)富集了黃酮生物合成和植物—病原互作相關(guān)基因，同時(shí)包含多個(gè)與花期相關(guān)的基因（如 DlFT1、DlELF4、DlSVP4、DlSVP5、DlSVP8、DlFDP）。其中，位于高分化區(qū)（HDR）的黃酮生物合成基因在龍眼的不同組織中均表現(xiàn)出顯著高表達(dá)。轉(zhuǎn)座元件（TEs）在這些結(jié)構(gòu)變異區(qū)高度富集，尤其以hAT、Mutator、LTR/Gypsy與LTR/Copia 為主，提示TE活動(dòng)可能促進(jìn)基因擴(kuò)張與基因組重塑，進(jìn)而影響龍眼特有的的抗性、代謝特征與花期調(diào)控。

為研究龍眼的開花機(jī)制，該研究在‘石硤’基因組中鑒定了577個(gè)開花通路的同源基因，并分析了它們?cè)诓煌_花模式下的表達(dá)情況。對(duì)五個(gè)栽培品種花芽與葉芽的基因表達(dá)分析顯示，自然開花主要受光周期、自主與春化途徑調(diào)控，并與赤霉素（GA）及蔗糖信號(hào)相互作用。在五個(gè)品種中，共鑒定出20個(gè)上調(diào)基因與16個(gè)下調(diào)基因表達(dá)趨同，并據(jù)此構(gòu)建了自然狀態(tài)下的開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。關(guān)鍵基因包括：光周期途徑（DlELF4, DlADO3/DlFKF1, DlLHY1b, DlLNK1）、春化途徑（DlPHB3, DlVIP3）、自主途徑（DlGRP7, DlKHZ1, DlGLK1_2, DlPRMT10）、開花整合子（DlFT1, DlSVP1, DlSVP4, DlSVP7, DlTFL1）及花分生組織決定基因（DlAP1, DlLFY, DlULT1）。龍眼特異性品種‘四季蜜’（cv. ‘Sijimi’）可在 5 – 35℃ 范圍內(nèi)全年持續(xù)開花，研究鑒定了六個(gè)光周期基因（DlCOR27/28, DlFKF1/ADO3, DlGI, DlPRR5, DlJMJ30）在該品種的花芽中特異性高表達(dá)，可能構(gòu)成其持續(xù)開花的分子基礎(chǔ)。

在KClO?誘導(dǎo)試驗(yàn)中，花芽誘導(dǎo)率在處理后41天達(dá)到64%，第54天達(dá)85%，明顯高于同期對(duì)照的25%，提早了成花轉(zhuǎn)變。對(duì)處理和對(duì)照的10個(gè)時(shí)間點(diǎn)的芽組織進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定到2,851個(gè)差異表達(dá)基因，其中包括193個(gè)轉(zhuǎn)錄因子、155個(gè)激素相關(guān)基因和70個(gè)開花基因。多數(shù)ERF、C2H2、WRKY與MYB家族轉(zhuǎn)錄因子呈下調(diào)趨勢(shì)，而MIKC-MADS家族成員在成花后期顯著上調(diào)，提示其在花芽分化后期發(fā)揮關(guān)鍵作用。

通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA），發(fā)現(xiàn)KClO3誘導(dǎo)開花經(jīng)歷了三個(gè)主要過程：應(yīng)激響應(yīng)與早期成花誘導(dǎo)（處理后10天），成花起始和花分生組織形成（處理后30天），花序原基發(fā)育及花器官形成（處理后54天）。進(jìn)一步分析表明，KClO?處理顯著激活GA信號(hào)：抑制GA生物合成的轉(zhuǎn)錄因子DWARF AND DELAYED FLOWERING 1 (DlDDF1)在處理后5天顯著下調(diào)（約255-fold），而GA生物合成酶DlGA3ox2與GA信號(hào)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子DlWRKY75_2在處理后10天顯著上調(diào)，從而促進(jìn)成花轉(zhuǎn)變。糖代謝關(guān)鍵基因DlSUS4在早期被激活，提示碳水化合物代謝為成花提供能量支持。中期時(shí)，自主途徑相關(guān)基因（DlHTA8, DlUGT87A2_1, DlVIM1, DlAGL6）上調(diào)，而成花抑制因子（如 DlSVP4, DlFLC1/2）被抑制。最終，這些調(diào)控事件整合為DlFT1的激活，并依次誘導(dǎo)DlAP1, DlFUL, DlLFY 等花分生組織分化基因。

鑒于龍眼缺乏成熟的轉(zhuǎn)化體系，該研究將早期響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子DlDDF1在擬南芥中過表達(dá)以驗(yàn)證其功能。過表達(dá)株系表現(xiàn)為抽薹延遲并伴隨蓮座葉數(shù)增加；KClO? 處理可部分逆轉(zhuǎn)這一表型，并顯著提高生物活性GA?含量，同時(shí)上調(diào)擬南芥內(nèi)源AtAP1與AtLFY的表達(dá)。這些結(jié)果支持KClO?通過激活GA信號(hào)通路來解除開花抑制、促進(jìn)成花的機(jī)制。

總體而言，該研究既完成了龍眼的高質(zhì)量參考基因組組裝，又系統(tǒng)揭示了自然與KClO?誘導(dǎo)開花的時(shí)序性分子網(wǎng)絡(luò)。研究成果為龍眼及其他熱帶果樹的全年連續(xù)生產(chǎn)、分子設(shè)計(jì)育種與種質(zhì)創(chuàng)新提供了重要的基因資源與理論依據(jù)，是我國在該領(lǐng)域的一項(xiàng)重要突破，有助于推動(dòng)熱帶果樹產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化發(fā)展。

福建農(nóng)林大學(xué)博士后趙國春與福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院副研究員姜帆為論文共同第一作者；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院首席科學(xué)家鄭少泉、福建農(nóng)林大學(xué)明瑞光教授以及華南農(nóng)業(yè)大學(xué)李建國教授為共同通訊作者。參與本研究的其他團(tuán)隊(duì)成員包括：福建農(nóng)林大學(xué)講師王文及科研助理涂四平，廣西大學(xué)張積森教授及其團(tuán)隊(duì)成員張清教授、博士生汪柏宇、已畢業(yè)碩士生梅靜、已畢業(yè)博士生齊浥穎及科研助理林聯(lián)宇，以及福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所胡文舜副研究員和陳秀萍研究員。

該研究受到國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家荔枝龍眼產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院省財(cái)政專項(xiàng)、農(nóng)業(yè)科研杰出人才及其創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目、國家園藝種質(zhì)福州龍眼枇杷分庫運(yùn)行服務(wù)項(xiàng)目與福建農(nóng)林大學(xué)啟動(dòng)資金的資助。

https://doi.org/10.1111/pbi.70433