非CG甲基化可促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，福建農(nóng)林大學(xué)朱方捷/上交九院黃晶合作解析WRKY順式元件組

DNA甲基化是最早被鑒定的表觀修飾。動(dòng)物基因組中DNA甲基化通常發(fā)生于CG二核苷酸，然而，植物中除CG甲基化外，還存在大量非CG甲基化（CHG和CHH，H=A/G/T）。非CG甲基化對(duì)植物轉(zhuǎn)座子沉默至關(guān)重要，同時(shí)也常見(jiàn)于啟動(dòng)子區(qū)（如CHH island）。前期研究認(rèn)為，非CG甲基化抑制轉(zhuǎn)錄因子（TF）結(jié)合【1，2】。然而，該結(jié)論假設(shè)DNA甲基化不改變TF序列特異性（即不改變TF基序），假設(shè)未必成立。

近日，福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院朱方捷教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院上海精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究院黃晶研究員團(tuán)隊(duì)在Nucleic Acids Research在線發(fā)表了題為The specificity landscape of WRKY transcription factors reveals the bidirectional influence of non-CG methylation。的研究論文。該研究開(kāi)發(fā)了高通量全甲基化系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)methyl-SELEX與methyl-ampDAP-seq，并利用其構(gòu)建了54個(gè)WRKY家族TFs的461個(gè)順式元件組文庫(kù)。數(shù)據(jù)分析表明，非CG甲基化可顯著改變WRKY序列特異性，且甲基化對(duì)WRKY親和力的調(diào)控具明顯雙向性——取決于結(jié)合模式、位置、以及具體WRKY因子，非CG甲基化既可抑制、也可促進(jìn)TF結(jié)合。同時(shí)，本工作提供了目前最完整的WRKY家族順式元件組數(shù)據(jù)集，構(gòu)建了WRKY數(shù)據(jù)庫(kù)WRCD（https://transysbio.cn/WRKYRCDB.php）。

該研究以擬南芥WRKY家族TFs為研究對(duì)象，利用SELEX、DAP-seq、ampDAP-seq以及建立的高通量methyl-SELEX、methyl-ampDAP-seq，系統(tǒng)研究了54個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子在非甲基化、體內(nèi)天然甲基化、全甲基化背景下的序列特異性及全基因組順式元件位點(diǎn)。共整理出201個(gè)WRKY單體基序（圖1上）。該研究既鑒定到WRKY家族傳統(tǒng)的順式元件，如W-box與WT-box，也鑒定到了大量新型WRKY順式元件。所有單體基序可聚為11類（圖1下），其中5類為首次報(bào)道的WRKY家族序列特異性（圖1下，粗體注釋的class）。11類單體基序中，類別1-5為非甲基化時(shí)WRKY的識(shí)別基序，類別6-11為甲基化時(shí)WRKY的識(shí)別基序，表明甲基化可顯著改變WRKY的序列特異性。此外，對(duì)于已報(bào)導(dǎo)的WRKY順式元件PRE4，分析表明其僅在甲基化條件下可被WRKY識(shí)別。

圖1：各WRKY識(shí)別的單體基序

該研究進(jìn)一步分析了有/無(wú)甲基化條件下WRKY二聚體的序列特異性，結(jié)果表明，甲基化不僅改變WRKY單體結(jié)合的序列特異性，也改變WRKY同源二聚體的序列特異性。

隨后，本工作系統(tǒng)解析了DNA甲基化對(duì)WRKY親和力的影響（圖2），證明了甲基化的影響具有明顯雙向性。（1）對(duì)于不同WRKY結(jié)合模式，其親和力對(duì)甲基化的響應(yīng)不同（圖2A）：盡管WRKY識(shí)別的非甲基化、甲基化基序中均含有C（或G），但對(duì)于非甲基化時(shí)WRKY識(shí)別的基序，相關(guān)序列甲基化時(shí)親和力減弱；對(duì)于甲基化時(shí)WRKY識(shí)別的基序，相關(guān)序列甲基化時(shí)親和力增強(qiáng)。（2）對(duì)于WRKY基序中不同位置的C，甲基化的影響也不同（圖2C、E）。例如對(duì)所有WRKY，C4位的DNA甲基化均減弱其親和力，但C7位的甲基化對(duì)親和力的影響則具多樣性——增加WRKY29/35等的親和力，但減弱WRKY46/65等的親和力。（3）此外，DNA甲基化不但雙向影響5mC自身與WRKY的親和力，也同時(shí)雙向影響附近A/T堿基的親和力（圖2F-H）。

進(jìn)一步比較ampDAP-seq與methyl-ampDAP-seq文庫(kù)表明，甲基化時(shí)，WRKY結(jié)合的全基因組順式元件也發(fā)生明顯的變化。然而，甲基化條件下，WRKY識(shí)別的順式元件仍靶向WRKY的經(jīng)典功能（SA通路、免疫反應(yīng)等），因此推測(cè)植物基因組中的甲基化順式元件也參與構(gòu)建了WRKY下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)WRKY行使正常生理功能具有重要意義。

圖2：甲基化既可促進(jìn)，也可抑制WRKY結(jié)合

最后，為促進(jìn)數(shù)據(jù)共享，本研究整合新產(chǎn)生數(shù)據(jù)與先前已發(fā)表的WRKY順式元件組數(shù)據(jù)，構(gòu)建了WRCD數(shù)據(jù)庫(kù)（圖3，https://transysbio.cn/WRKYRCDB.php）。

圖3：WRKY順式元件組數(shù)據(jù)庫(kù)

綜上，該研究繪制了WRKY順式元件組圖譜，揭示了非CG甲基化可雙向影響WRKY親和力，并可重塑WRKY的下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。所揭示的雙向性影響為合成生物學(xué)中順式元件的設(shè)計(jì)提供了重要參考：例如植物轉(zhuǎn)基因時(shí)，外來(lái)基因常被DNA甲基化沉默，根據(jù)本研究數(shù)據(jù)，有望設(shè)計(jì)出甲基化條件下仍能結(jié)合TF并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的順式元件。

福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院已畢業(yè)博士研究生馬娜娜、已畢業(yè)碩士研究生蔣定坤、未來(lái)技術(shù)學(xué)院博士研究生李甜、浙江大學(xué)博士后羅琳為該論文共同第一作者。福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院朱方捷教授、生命科學(xué)學(xué)院郭洪洪講師、上海精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究院黃晶研究員為該論文的共同通訊作者。該研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、福建省“雛鷹計(jì)劃”、福建省重大專項(xiàng)以及福建農(nóng)林大學(xué)的資助。

參考文獻(xiàn)：

1. Charvin, M. et al. Single-cytosine methylation at W-boxes repels binding of WRKY transcription factors through steric hindrance. Plant Physiol.192, 77–84 (2023).

2. O’Malley, R. C. et al. Cistrome and epicistrome features shape the regulatory DNA landscape. Cell165, 1280–1292 (2016).

https://academic.oup.com/nar/article/53/21/gkaf1168/8328560?searchresult=1