Nat Commun |復旦張榮團隊構建復制缺陷型猴痘病毒平臺應用于基礎研究和藥物發現

近日，復旦大學基礎醫學院/上海市重大傳染病和生物安全研究院張榮團隊等合作在Nature Communications發表題為“Development of a replication-defective mpox virus platform for fundamental and therapeutic research”重要研究成果。該研究成功構建了基于細菌人工染色體（BAC）的復制缺陷型猴痘病毒（replication-defective MPXV, rdMPXV）平臺。該平臺通過雙基因（OPG96/OPG158）缺失策略獲得了單輪感染的復制缺陷型病毒顆粒，完整保留了病毒的生命周期關鍵環節。研究者以此為工具，完成了概念驗證性高通量藥物篩選，發現了新型抗痘病毒先導化合物G243-1720，并意外發現該化合物與已獲批藥物特考韋瑞（tecovirimat）雖結構迥異，卻共享同一靶點（OPG57/F13），通過誘導靶蛋白二聚化發揮抑制作用。本研究不僅為猴痘病毒的基礎研究提供了安全、靈活且強大的遺傳學操作平臺，也為抗痘病毒藥物和疫苗研發開辟了新路徑。

研究背景與挑戰：猴痘病毒研究的“高墻”

猴痘病毒(MPXV) 隸屬痘病毒科正痘病毒屬，該病毒與天花病毒、痘苗病毒及牛痘病毒等重要病原體存在密切親緣關系。2022年MPXV Clade IIb在世界范圍內的流行以及2024年的MPXV Ib分支病例的大量增加致使世界衛生組織兩次將其列為國際關注的突發公共衛生事件 (PHEIC)，揭示了MPXV持續演變的公共衛生威脅。目前臨床可用的抗MPXV藥物寥寥（僅tecovirimat和cidofovir/brincidofovir），且存在療效不確定性或毒副作用等問題。然而，猴痘病毒近200kb龐大且復雜的病毒基因組以及對其操作所需的高生物安全級別限制了科學家對其復制機制、宿主互作、疫苗開發和抗病毒化合物篩選的研究。傳統的基于同源重組和篩選標記的基因編輯方法對MPXV效率低下、流程繁瑣。因此，開發一種能在較低生物安全條件下模擬活病毒關鍵生命周期的研究平臺，具有重要的科學與臨床意義。

技術創新：構建穩定、安全的rdMPXV平臺

1.從“頭”組裝策略
研究團隊摒棄了從感染性病毒出發的傳統改造路徑，采用了從頭合成（de novo）策略。利用酵母轉化相關重組（TAR）克隆技術，將MPXV Clade IIb基因組（~197 kb）分為23個片段進行逐步組裝，構建了含有病毒囊膜組裝關鍵蛋白基因OPG96 (M2R) 缺失的中間質粒pBAC-IΔ96，并進一步組裝了猴痘病毒全基因組的BAC質粒pBAC-MPXVΔ96。隨后在互補表達OPG96的細胞上，成功包裝出復制缺陷型猴痘病毒顆粒（rdMPXVΔ96）。

2.雙重基因缺失
為進一步提升安全性，研究團隊在pBAC-IΔ96基礎上，創新性地結合CRISPR-Cas9與Lambda Red重組系統，在E. coli中敲除了第二個病毒囊膜組裝關鍵蛋白基因OPG158 (A32.5L)，獲得雙基因同時缺失的質粒pBAC-IΔ96,158。隨后在互補表達OPG96和OPG158的細胞上，成功包裝出雙缺型復制缺陷型猴痘病毒顆粒（rdMPXVΔ96,158）。

3.平臺特性驗證：安全性與保真度

·嚴格的復制缺陷性：rdMPXVΔ96,158只能在互補細胞系中完成多輪復制，在野生型細胞中僅發生單輪感染，不能產生子代病毒顆粒。在睡鼠（dormice）模型中，該病毒不引起體重下降或肺部有效復制，證明了其體內安全性。

·生命周期模擬能力：在互補細胞中電鏡可觀察到完整的胞內成熟病毒（IMV）和胞外包膜病毒（EEV）形態；病毒表現出與野生型病毒相似的細胞嗜性。

·平臺穩定性：通過連續傳代后，病毒基因組在缺失區域和報告基因區域均未出現突變。

·藥效評價可靠性：使用該平臺測定的中和抗體（7D11）以及特考韋瑞和西多福韋的EC50值，與文獻中使用野生型病毒報道的結果高度一致，驗證了平臺用于藥效評估的可靠性。

平臺應用：發現新型先導化合物G243-1720

1.先導化合物的發現與特征

作為概念驗證，研究者利用rdMPXVΔ96,158平臺對包含3185個小分子的化合物庫進行了高通量篩選。篩選鑒定出化合物G243-1720，其抗MPXV活性EC50約0.23 μM，CC50 > 100 μM，選擇指數（SI）優異。該化合物對多種正痘病毒（VACV、CPXV、CMLV、RPXV）均表現出廣譜抑制活性，但對禽痘病毒、皰疹病毒及RNA病毒無效，體現了其作用靶點的保守性與特異性。在SCID小鼠的MPXV感染模型中，腹腔注射（22.5 mg/kg）或口服（45 mg/kg）G243-1720，可顯著降低肺部組織病毒載量。

2.機制深度解析：與特考韋瑞殊途同歸

通過系統分析病毒復制周期關鍵節點，發現G243-1720與特考韋瑞類似，不影響病毒入侵細胞、基因組DNA復制、晚期基因表達和IMV的形成，但能顯著抑制EEV的產生和病毒噬斑擴散。 在G243-1720壓力下進行病毒傳代，篩選出位于 OPG57 (F13L) 基因的耐藥突變（A290V、D294V、I372N）。這些位點正是已知的特考韋瑞和另一個F13抑制劑IMCBH的經典耐藥位點。攜帶I372N突變的病毒對G243-1720和特考韋瑞均表現出交叉耐藥，提示二者靶向同一蛋白。

分析超速離心（AUC）和質譜光度法（mass photometry）證實，G243-1720與tecovirimat一樣，能誘導可溶性OPG57蛋白形成同源二聚體。耐藥突變顯著削弱了這種誘導能力。盡管晶體學數據分辨率有限，但在OPG57蛋白二聚體界面觀察到了與G243-1720分子形狀匹配的電子密度，進一步支持其結合于tecovirimat相同的口袋。

總結和展望

1.創建了一個創新性的復制缺陷性猴痘病毒研究平臺

·安全性高：雙基因缺失設計，單輪感染特性，將實驗操作的安全性要求降低。

·功能完整：模擬病毒生命周期，適用于病毒進入、復制等多環節研究。

·靈活高效：基于BAC和CRISPR/Lambda Red系統，允許對龐大基因組進行快速、多重的遺傳操作。

·轉化性強：已成功用于高通量藥物篩選、中和抗體評價、宿主因子鑒定等。

2.發現了一個新型先導化合物G243-1720

作為第三個被報道的OPG57（F13）蛋白抑制劑，具有全新的化學骨架，與特考韋瑞“殊途同歸”的作用機制，不僅驗證了OPG57作為抗痘病毒藥物的有效靶點，也為開發具有不同藥學特性的備份藥物或聯合用藥方案奠定了基礎。

總之，復制缺陷型猴痘病毒平臺可用于更廣泛的宿主-病毒互作研究、疫苗評估及大規模藥物篩選，以及作為載體開發新型疫苗等。G243-1720作為先導化合物則還需進行系統的開發，包括結構優化、安全性評價以及在不同動物模型中的療效驗證等，以期為應對猴痘及其他正痘病毒威脅提供新的候選藥物。

復旦大學基礎醫學院/上海市重大傳染病和生物安全研究院張榮研究員，中山大學張萍教授、法國巴斯德所Pablo Guardado-Calvo研究員、中國農科院長春獸醫研究所魯會軍研究員以及復旦大學謝幼華教授為本文共同通訊作者。復旦大學博士后陳建南和博士生胡力元、法國巴斯德所Riccardo Vernuccio、吉林大學史寧為共同第一作者。該研究得到了中科院藥物研究所Geoffrey L. Smith和陸泳旭研究員、 復旦大學蔡啟良教授、中國醫科院醫學實驗動物研究所薛婧研究員等的指導和幫助。該研究也得到了上海市市級科技重大專項“重大突發傳染病防控關鍵核心技術研究”、上海市優秀學術帶頭人項目等的資助。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-025-67487-w

編輯：吃一口小貓