曾獲諾貝爾獎的固相多肽合成是啥？應用中會有哪些問題？

一、定義與核心概念

固相合成（Solid-Phase Synthesis, SPS）是一種在固相載體上逐步構建有機分子的化學合成方法，尤其以固相多肽合成（ solid phase peptide synthesis, SPPS）最為著名。其核心原理是將目標分子的第一個單體（如氨基酸）通過化學鍵固定在不可溶的樹脂載體上，隨后依次添加后續單體，并通過重復的脫保護、偶聯和洗滌步驟完成鏈式延伸，最終切割樹脂得到目標產物，此反應極大的減小了多肽合成的難度。固相肽合成是肽合成化學的重要突破。其主要特點是無需純化中間產物，合成過程可以連續進行，為多肽合成的自動化奠定了基礎。目前多肽的全自動合成基本上是固相合成。

二、發展脈絡

1、奠基階段 ----- 多肽合成研究已經走過了一百多年的光輝歷程。1902年，Emil Fischer首先開始關注多肽合成，由于當時在多肽合成方面的知識太少，進展也相當緩慢，直到1932年，Max Bergmann等人開始使用芐氧羰基(Z)來保護α-氨基，多肽合成才開始有了一定的發展。

到了20世紀50年代，有機化學家們合成了大量的生物活性多肽，包括催產素，胰島素等，同時在多肽合成方法以及氨基酸保護基上面也取得了不少成績，這為后來的固相合成方法的出現提供了實驗和理論基礎。

1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS)，這個在多肽化學上具有里程碑意義的合成方法，一出現就由于其合成方便，迅速，成為多肽合成的首選方法，而且帶來了多肽有機合成上的一次革命，并成為了一支獨立的學科——固相有機合成(SPOS)。因此，Merrifield榮獲了1984年的諾貝爾化學獎。Merrifield經過了反復的篩選，最終摒棄了芐氧羰基(Z)在固相上的使用，首先將叔丁氧羰基(BOC)用于保護α-氨基并在固相多肽合成上使用，同時，Merrifield在60年代末發明了第一臺多肽合成儀，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶(124個氨基酸)。

1972年，Lou Carpino首先將9-芴甲氧羰基(FMOC)用于保護α-氨基，其在堿性條件下可以迅速脫除，10min就可以反應完全，而且由于其反應條件溫和，迅速得到廣泛使用，以BOC和FMOC這兩種方法為基礎的各種肽自動合成儀也相繼出現和發展，并仍在不斷得到改造和完善。同時，固相合成樹脂，多肽縮合試劑以及氨基酸保護基，包括合成環肽的氨基酸正交保護上也取得了豐碩的成果。

2、技術革新---- Fmoc保護基的引入：1972年，路易斯·卡彭特（Louis Carpino）開發了Fmoc（9-芴甲氧羰基）保護策略。與Boc需強酸（如三氟乙酸，TFA）脫保護不同，Fmoc可通過溫和的堿性條件（如哌啶）脫除，減少副反應，尤其適用于復雜多肽和自動化合成。自動化合成儀：1980年代，首臺商業多肽合成儀問世，大幅提升了合成通量和精度。

3、成熟與擴展（1990年代至今）---- 樹脂與試劑的優化：開發了高載量、親水性的PEG修飾樹脂（如Tentagel），以及高效偶聯試劑（如HBTU、HATU）。應用拓展：從多肽延伸至寡核苷酸、多糖及小分子化合物合成。技術融合：微波輔助合成、流動化學等新方法進一步縮短反應時間并提高產率。

三、技術詳解 1. 基本原理與步驟

固相載體：常用樹脂包括聚苯乙烯（疏水性）和PEG接枝樹脂（親水性），功能基團如Wang樹脂（羥基）、Rink酰胺樹脂（氨基）決定產物C端結構。

保護策略：

Boc法：Boc保護氨基，需TFA脫保護；適合短肽，但長鏈易因強酸累積損傷。

Fmoc法：Fmoc保護氨基，哌啶脫保護；條件溫和，兼容側鏈多樣化保護（如t-Bu、Trt基團）。

要成功合成具有特定的氨基酸順序的多肽，需要對暫不參與形成酰胺鍵的氨基和羧基加以保護，同時對氨基酸側鏈上的活性基因也要保護，反應完成后再將保護基因除去。同液相合成一樣，固相合成中多采用烷氧羰基類型作為α氨基的保護基，因為這樣不易發生消旋。最早是用芐氧羰基，由于它需要較強的酸解條件才能脫除，所以后來改為叔丁氧羰基（BOC）保護，用TFA（三氟乙酸）脫保護，但不適用含有色氨酸等對酸不穩定的肽類的合成。changMeienlofer和Atherton等人采用Carpino報道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作為α氨基保護基，Fmoc基對酸很穩定，但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脫去，近年來，Fmoc合成法得到了廣泛的應用。羧基通常用形成酯基的方法進行保護。甲酯和乙酯是逐步合成中保護羧基的常用方法，可通過皂化除去或轉變為肼以便用于片斷組合；叔丁酯在酸性條件下除去；芐酯常用催化氫化除去。對于合成含有半胱氨酸、組氨酸、精氨酸等帶側鏈功能基的氨基酸的肽來說，為了避免由于側鏈功能團所帶來的副反應，一般也需要用適當的保護基將側鏈基團暫時保護起來。保護基的選擇既要保證側鏈基團不參與形成酰胺的反應，又要保證在肽合成過程中不受破壞，同時又要保證在最后肽鏈裂解時能被除去。如用三苯甲基保護半胱氨酸的S-，用酸或銀鹽、汞鹽除去；組氨酸的咪唑環用2,2,2-三氟-1-芐氧羰基和2,2,2-三氟-1-叔丁氧羰基乙基保護，可通過催化氫化或冷的三氟乙酸脫去。精氨酸用金剛烷氧羰基（Adoc）保護，用冷的三氟乙酸脫去。

固相中的接肽反應原理與液相中的基本一致，將兩個相應的氨基被保護的及羧基被保護的氨基酸放在溶液內并不形成肽鍵，要形成酰胺鍵，經常用的手段是將羧基活化，變成混合酸酐、活潑酯、酰氯或用強的失去劑（如碳二亞氨）形成對稱酸酐等方法來形成酰胺鍵。其中選用DCC、HOBT或HOBT/DCC的對稱酸酐法、活化酯法接肽應用最廣。

裂解及合成肽鏈的純化 BOC法用TFA+HF裂解和脫側鏈保護基，FMOC法直接用TFA，有時根據條件不同，其它堿、光解、氟離子和氫解等脫保護方法也被采用。合成肽鏈進一步的精制、分離與純化通常采用高效液相色譜、親和層析、毛細管電泳等。

合成循環：

• 脫保護：移除氨基保護基（Fmoc用20%哌啶/DMF）。

• 偶聯：活化羧酸的氨基酸（如用HBTU/HOBt/DIEA）與樹脂上的游離氨基反應。

• 洗滌：DMF、DCM等溶劑去除未反應試劑。

切割與純化：合成完成后，用TFA（含清除劑如H?O、TIS）切割樹脂與多肽間的連接鍵，經HPLC和質譜純化鑒定。

2. 關鍵試劑與載體

偶聯試劑：HBTU/HATU（提高偶聯效率）、DIC/Oxyma（減少消旋化）。

樹脂類型：

Wang樹脂：適用于羧酸終產物（如游離酸或酯）。

Rink酰胺樹脂：生成C端酰胺化多肽（類似天然蛋白結構）。

側鏈保護基：如Trityl（Trt）保護半胱氨酸，Pbf保護精氨酸，防止副反應。

C端羧肽合成可選用Wang樹脂；對于C端酰胺肽的合成，可選擇Rink Amide AM Resin或Rink Amide MBHA Resin；對于全保護肽的合成，我們可以選擇2-Cl Trt Resin。

樹脂的參數及其含義：
一般樹脂的參數包括載量、目數和規格，如1% DVB。
載量：單位為mmol/g，即每克樹脂存在多少毫摩爾官能團。
目數：粒度一般為100-200目，數值越大，顆粒越細。
1% DVB：交聯劑二乙烯基苯在苯乙烯和二乙烯基苯共聚物中的比例。

固相多肽合成廣泛應用于藥物開發領域，如合成胰島素類似物、GLP-1受體激動劑（如利拉魯肽），定制表位肽用于抗體生產或蛋白相互作用研究。固相合成技術正朝著高通量、綠色化學（減少溶劑浪費）和智能化（AI優化序列設計）方向發展。新型載體（如可降解樹脂）和連續流反應器有望進一步突破合成極限，推動合成生物學與精準醫療的進步。

參考文獻：

1. Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc., 85(14), 2149–2154.

2. Chan, W.C., & White, P.D. (2000). Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. Oxford University Press.

3. Henninot, A., et al. (2018). J. Med. Chem., 61(4), 1382–1414.

固相多肽合成中可能出現的問題：

1. 什么是凈肽含量（肽含量），其意義是什么？
多肽的干重不僅包含肽本身，還包括水分、吸附溶劑、配位離子及鹽類等非肽成分。凈肽含量指肽在該混合物中的重量百分比，范圍通常在50%-90%之間，具體取決于純度、序列及合成/純化方法。凈肽含量不可與肽純度混淆——二者概念不同：純度通過高效液相色譜（HPLC）測定，表示正確序列組分的百分比；而凈肽含量量化的是肽材料相對于非肽物質的比例。凈肽含量通常通過氨基酸組成分析或紫外分光光度法測定，這對肽濃度敏感的實驗至關重要。

2. 多肽生產的常用方法有哪些？
線性肽采用Fmoc固相法從C端向N端延伸合成。首個氨基酸通過酸敏連接劑固定于不溶性樹脂上，經哌啶去除Fmoc保護基后，耦聯第二個Fmoc保護氨基酸。活化方式包括預活化或“一鍋法”。完成目標序列后，用三氟乙酸（TFA）將肽從樹脂上切下，獲得粗產物。

3. 如何根據實驗選擇肽純度？

純度需求依實驗目的而定：

• 篩選實驗（低靈敏度）：粗品＞75%

• 免疫實驗：＞85%

• 受體-配體研究、生物測定或細胞實驗：＞95%

• 結構研究：＞98%

4. 為何合成含Cys、Met或Trp的肽較困難？
這些殘基易氧化，合成高純度含此類殘基的肽需特殊工藝，儲存時需避免反復接觸空氣。

5. 若肽純度為95%，剩余5%是什么？
主要為耦聯步驟不完善產生的氨基酸缺失副產物，因其色譜性質相似，常與目標肽共同洗脫。

6. 未HPLC純化的肽含哪些雜質？
粗品或脫鹽肽可能含截短肽、殘留溶劑（如DTT、TFA）及合成試劑。

7. 最佳肽長度是多少？
合成效率隨長度增加（＞20殘基）下降。短肽（5殘基）建議使用疏水性氨基酸以簡化純化；功能域兩側建議添加親水/帶電殘基提升溶解性。

8. 如何從序列預測肽溶解性？

• 疏水殘基（Leu、Val、Ile、Met、Phe、Trp）＞50%：可能難溶于水

• 帶電殘基（Lys、Arg、His、Asp、Glu）≥20%：溶解性佳

• 中性肽：需有機溶劑（如DMSO、乙腈）

9. 如何純化多肽？采用反相HPLC（C8/C18柱），以TFA/乙腈梯度洗脫。疏水肽可能需甲酸或乙酸。長肽（＞20aa）需質譜鑒定目標峰。

10. 如何計算Fmoc-氨基酸樹脂載量？
兩種方法：
(1) 耦聯后增重除以分子量與樹脂質量
(2) 紫外吸光度分析：如果肽段序列中含有Trp或Tyr，可用紫外法分析肽段的含量，根據摩爾消光系數：
色氨酸 5,560 AU/mmole/ml
酪氨酸 1,200 AU/mmole/ml
（280 nm at 中性pH使用 1 cm 比色皿）
肽的摩爾消光系數可以根據每個色氨酸或酪氨酸的系數相加，然后根據在 280 nm 處測得的吸光值按公式計算。
mg 肽/ml = (A280 x DF x MW) / e
A280，280 nm 處的實際吸收值（1 cm 池），
DF，稀釋因子，
MW，肽的分子量
e，肽的摩爾消光系數

11. 如何溶解多肽？

• 凈電荷＞0（堿性）：溶于水；可加乙酸（≥10%）或TFA

• 凈電荷=0（酸性）：溶于水；可加氨水

• 中性電荷：用有機溶劑（如DMSO、乙腈）或尿素

12. 如何儲存合成肽？

• 長期：凍干、干燥后-20°C保存

• 含Cys/Met/Trp的肽：用脫氧緩沖液；避免反復凍融

• 含Gln/Asn的肽：因易降解，保質期有限

13. 如何處理肽末端？

肽用于模擬蛋白質。為了模擬蛋白質的表達，我們需要合成與蛋白質具有相似結構和電荷的肽。當一個肽從蛋白質中“切出”時，兩端的電荷數將與基因體蛋白的電荷數不同。我們需要改變合成策略以使它們保持一致。一般來說，如果來自蛋白質的C端，N端被乙酰化屏蔽；如果它來自蛋白質的N端，則C端被酰胺化屏蔽；如果它來自蛋白質的中間部分，則兩端被乙酰化和酰胺化屏蔽。

編輯自：

1、

2、百度百科：https://baike.baidu.com/item/%E5%A4%9A%E8%82%BD%E5%9B%BA%E7%9B%B8%E5%90%88%E6%88%90%E6%B3%95/7327635