DNA組裝技術(shù)，登上Nature！

在生物學(xué)研究與工程領(lǐng)域，從頭構(gòu)建全新的合成DNA序列至關(guān)重要。然而，當(dāng)前合成復(fù)雜長(zhǎng)鏈DNA及其文庫(kù)的能力，遠(yuǎn)落后于DNA測(cè)序與編輯技術(shù)的發(fā)展。現(xiàn)有所有DNA組裝技術(shù)都依賴最終構(gòu)建體中的DNA序列信息來指導(dǎo)DNA分子間的連接，導(dǎo)致無法在不影響最終序列的前提下對(duì)組裝指令進(jìn)行深度優(yōu)化，從而嚴(yán)重限制了合成結(jié)構(gòu)的效率、尺寸與復(fù)雜度。

近日，加州理工學(xué)院王開航教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)出一種名為Sidewinder的新型DNA組裝技術(shù)，該技術(shù)利用DNA三向連接結(jié)構(gòu)，成功將指導(dǎo)組裝的信息與最終組裝序列分離開來，實(shí)現(xiàn)了真正獨(dú)立于序列的DNA組裝。研究者展示了Sidewinder的強(qiáng)大能力：高穩(wěn)健且精確地完成了40片段的多重組裝、高GC含量與高重復(fù)序列的復(fù)雜DNA構(gòu)建、同一反應(yīng)中多個(gè)不同基因的并行組裝，以及在整個(gè)基因長(zhǎng)度上覆蓋44萬余種變體的組合文庫(kù)構(gòu)建。該技術(shù)在連接點(diǎn)的誤接率僅為約百萬分之一。相關(guān)內(nèi)容以“Construction of complex and diverse DNA sequences using DNA three-way junctions”為題發(fā)表在《

Nature

Sidewinder技術(shù)的核心在于其與所有傳統(tǒng)技術(shù)的根本區(qū)別：它利用第三個(gè)獨(dú)特的螺旋中編碼的信息，通過形成DNA三向連接來指導(dǎo)DNA片段間的組裝。該三向連接由“ 立足點(diǎn)”（ foothold）與“條形碼”共同作用形成。其中，條形碼序列不進(jìn)入最終產(chǎn)物，從而解除了對(duì)組裝位置、序列內(nèi)容及片段數(shù)量的限制。實(shí)驗(yàn)證明，只有同時(shí)具備互補(bǔ)條形碼和互補(bǔ)立足點(diǎn)的片段才能成功連接，確保了組裝的高特異性。

圖1 | Sidewinder利用三向連接實(shí)現(xiàn)真正獨(dú)立于序列的DNA組裝。 a. Sidewinder通過形成三向連接指導(dǎo)DNA組裝。Sidewinder片段包含短 foothold對(duì)和長(zhǎng)的獨(dú)特條形碼對(duì)。DNA組裝由條形碼對(duì)引導(dǎo)。條形碼對(duì)的結(jié)合將兩個(gè)片段拉近，并由 foothold對(duì)進(jìn)一步穩(wěn)定以形成三向連接。 foothold被連接到相鄰片段，不可逆地將兩個(gè)片段連接。隨后移除條形碼螺旋，恢復(fù)雙向連接，實(shí)現(xiàn)無縫組裝。 b. 兩片段連接需要互補(bǔ)的 foothold和條形碼對(duì)。用熒光染料Cy3標(biāo)記的片段Y與四種可能的片段X之一進(jìn)行組裝。 c. 圖b中四個(gè)反應(yīng)及對(duì)照在不染色的TBE-尿素變性凝膠上電泳，僅追蹤含熒光團(tuán)分子的遷移。凝膠通過未連接產(chǎn)物與連接產(chǎn)物遷移差異展示連接效率，連接產(chǎn)物僅出現(xiàn)在條件完全匹配的泳道。

在規(guī)?；瘧?yīng)用方面，Sidewinder展現(xiàn)出卓越性能。研究人員成功將編碼LuxABCDE操縱子的DNA序列拆分為5、10、20乃至40個(gè)片段進(jìn)行組裝，均獲得單一、清晰的目標(biāo)條帶，無錯(cuò)誤組裝跡象。相比之下，傳統(tǒng)的聚合酶循環(huán)組裝等方法在超過5個(gè)片段后即告失敗。對(duì)40片段組裝產(chǎn)物的納米孔測(cè)序分析顯示，超過96%的讀段為正確組裝的完整產(chǎn)物。特別地，Sidewinder還能攻克傳統(tǒng)方法難以處理的復(fù)雜序列。例如，研究人員成功組裝了GC含量高達(dá)70%（局部達(dá)95%）的人類載脂蛋白E基因編碼序列，以及一段具有高度重復(fù)序列的絲蛋白基因片段。即使在故意設(shè)計(jì)為所有片段 foothold序列完全相同的極端條件下，Sidewinder依然能高效完成正確組裝，突顯了其條形碼引導(dǎo)機(jī)制的優(yōu)勢(shì)。

圖2 | Sidewinder以高精度可靠組裝大型多片段構(gòu)建體。 a. Sidewinder片段異源雙鏈由單鏈條形碼與編碼寡核苷酸退火形成。 b. Sidewinder片段單獨(dú)處理后混合進(jìn)行組裝反應(yīng)。片段通過其高保真條形碼的引導(dǎo)與正確伙伴結(jié)合，并在形成三向連接后被連接。所有條形碼寡核苷酸通過DNA聚合酶延伸引物被置換或破壞，從而在整個(gè)組裝體中恢復(fù)雙向連接。此步驟可整合到選擇性PCR中進(jìn)一步擴(kuò)增產(chǎn)物。 c. DNA瓊脂糖凝膠展示PCR產(chǎn)物，比較了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的寡核苷酸組裝技術(shù)與Sidewinder隨組裝規(guī)模和片段數(shù)量增加的表現(xiàn)。僅Sidewinder成功完成了40片段組裝。 d. 對(duì)40片段Sidewinder組裝產(chǎn)物的納米孔測(cè)序讀段分析餅圖，顯示準(zhǔn)確組裝與副產(chǎn)物的比例。 e. 分析40片段組裝納米孔測(cè)序數(shù)據(jù)中所有可能的連接組合，比較正確與錯(cuò)誤連接的數(shù)量。

圖3 | Sidewinder組裝復(fù)雜DNA序列（高GC含量與高重復(fù)序列）。 a. 人載脂蛋白E基因的GC含量分布圖。 b. 12片段Sidewinder組裝產(chǎn)物的DNA瓊脂糖凝膠圖，顯示單一純凈條帶。 c. 對(duì)上述產(chǎn)物的納米孔測(cè)序分析餅圖。 d. 對(duì)高GC含量組裝產(chǎn)物的連接點(diǎn)分析，顯示所有檢測(cè)到的連接均為正確連接。 e. 采用完全相同 foothold序列的5片段重復(fù)序列組裝設(shè)計(jì)示意圖。 f. 該5片段相同 foothold組裝產(chǎn)物的DNA瓊脂糖凝膠圖，顯示強(qiáng)目標(biāo)條帶。 g. 對(duì)該組裝產(chǎn)物的納米孔測(cè)序分析餅圖。 h. 對(duì)該組裝產(chǎn)物的連接點(diǎn)分析，顯示在極端條件下仍具有極高的連接準(zhǔn)確性。

該技術(shù)的另一大亮點(diǎn)是能夠在同一反應(yīng)管中并行組裝多個(gè)不同的構(gòu)建體。研究者將編碼mScarlet、mGL和aeBlue三種不同顏色表型標(biāo)記的基因片段混合，在“一鍋法”反應(yīng)中同時(shí)進(jìn)行組裝，并通過選擇性擴(kuò)增分別獲得單一、純凈的目標(biāo)產(chǎn)物。測(cè)序分析證實(shí)了各自組裝的高保真度，轉(zhuǎn)化后的菌落也僅呈現(xiàn)預(yù)期的顏色。

圖4 | Sidewinder在單反應(yīng)中獨(dú)立并行組裝多個(gè)不同構(gòu)建體且保真度高。 a. 三種對(duì)應(yīng)不同表型標(biāo)記的十片段組裝Sidewinder片段在同一反應(yīng)管中混合并行組裝。 b. DNA瓊脂糖凝膠顯示各單獨(dú)構(gòu)建體以及三者混合物的最終PCR產(chǎn)物，均有單一強(qiáng)目標(biāo)條帶。 c. 對(duì)單獨(dú)及混合組裝的納米孔測(cè)序分析餅圖。 d. 對(duì)單獨(dú)擴(kuò)增構(gòu)建體的納米孔測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行連接點(diǎn)分析。 e. 組裝產(chǎn)物克隆轉(zhuǎn)化后，混合池平板在環(huán)境光與藍(lán)光疊加下的顯色照片。

此外，Sidewinder在構(gòu)建大規(guī)模組合DNA文庫(kù)方面潛力巨大。研究團(tuán)隊(duì)將熒光蛋白eGFP的基因分成10個(gè)片段，并在17個(gè)位點(diǎn)預(yù)定義密碼子變異，構(gòu)建了一個(gè)理論容量為442,368種變體的組合文庫(kù)。PacBio高通量測(cè)序分析顯示，文庫(kù)覆蓋了超過91.7%的可能組合，且連接點(diǎn)誤接率極低。該文庫(kù)通過熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)進(jìn)行篩選，成功分離出具有藍(lán)、綠、黃、紅等不同熒光發(fā)射特征的變體，證明了其能夠組裝出高度多樣且功能完整的分子文庫(kù)。

圖5 | Sidewinder組裝具有高覆蓋率的大型組合文庫(kù)。 a. 通過將條形碼寡核苷酸與含預(yù)定突變的編碼寡核苷酸退火生成Sidewinder文庫(kù)片段。 b. 熒光蛋白文庫(kù)十片段組裝示意圖。 c. 文庫(kù)組裝PCR產(chǎn)物的DNA瓊脂糖凝膠圖，顯示單一強(qiáng)目標(biāo)條帶。 d. 對(duì)克隆前Sidewinder文庫(kù)的PacBio測(cè)序分析餅圖。 e. 文庫(kù)PacBio測(cè)序數(shù)據(jù)的連接點(diǎn)分析。 f. 用于組裝的寡核苷酸（排除預(yù)定突變位點(diǎn)及其側(cè)翼堿基）的每堿基準(zhǔn)確性分布小提琴圖與箱線圖。 g. 密碼子水平的突變多樣性，顯示克隆前實(shí)驗(yàn)分布與理論分布。 h. 基因水平的突變多樣性，顯示克隆前與克隆后測(cè)序讀段分配到各可能突變組合的比例。 i. 所有可能突變組合的序列空間，以及克隆前、克隆后測(cè)序中出現(xiàn)的組合。 j. 克隆前與克隆后測(cè)序中觀察到的所有變體比例相對(duì)關(guān)系圖。 k. 考慮Sidewinder文庫(kù)17個(gè)多樣化位點(diǎn)中任意N個(gè)突變位點(diǎn)組合時(shí)所實(shí)現(xiàn)的多樣性百分比。 l. 熒光面積與高度散點(diǎn)圖，顯示藍(lán)、綠、黃、紅熒光陽(yáng)性群體。

綜上所述，Sidewinder技術(shù)通過三向連接結(jié)構(gòu)將序列信息與組裝指令解耦，實(shí)現(xiàn)了真正獨(dú)立于序列的DNA組裝，能夠構(gòu)建以往難以實(shí)現(xiàn)的復(fù)雜、多樣DNA序列。其組裝能力僅受輸入DNA質(zhì)量和大小的限制，而不會(huì)引入額外錯(cuò)誤。該技術(shù)為大規(guī)模并行組裝、超復(fù)雜序列合成以及高覆蓋率組合文庫(kù)構(gòu)建提供了強(qiáng)大工具，有望在合成基因組學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、材料科學(xué)及AI輔助的生物設(shè)計(jì)等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，推動(dòng)從計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)到物理分子快速、可擴(kuò)展生成的連接。