PNAS | 華東師范大學(xué)李超團(tuán)隊(duì)和北京大學(xué)雷曉光團(tuán)隊(duì)在植物FERONIA受體激酶的小分子抑制劑開發(fā)領(lǐng)域取得新進(jìn)展

FERONIA（FER）屬于長春花受體激酶家族CrRLK1L的核心成員之一，具有胞外區(qū)、跨膜區(qū)及細(xì)胞內(nèi)激酶區(qū)的典型結(jié)構(gòu)，這決定了其通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控植物發(fā)育的重要性。近二十年研究表明，F(xiàn)ER受體激酶在植物生長發(fā)育、抗逆及抗病中發(fā)揮重要作用。而FER對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及作物性狀改良方面有待進(jìn)一步深入研究。因此，開發(fā)高效的FER小分子工具，對于揭示其在精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)中的調(diào)控機(jī)制具有重大意義。

2025年11月6日，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心雷曉光團(tuán)隊(duì)與華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李超團(tuán)隊(duì)在PNAS上在線發(fā)表題為Unveiling FERONIA Receptor Kinase-mediated Cellular Mechanisms with Small Molecule Inhibitor的研究論文。作者通過高通量篩選及根毛表型實(shí)驗(yàn)，從4,378種化合物中鑒定出OTSSP167（命名Ferovicin，簡稱FRV）。通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)發(fā)現(xiàn)FRV結(jié)合于FER激酶結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合口袋。利用定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)和FRV小分子工具，發(fā)現(xiàn)FRV抑制RALF1-FER-AHA2級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞外環(huán)境堿化，調(diào)控細(xì)胞伸長。同時(shí)，RALF1通過促使FER的Ser695位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激活其功能。

本研究通過解析FER激酶區(qū)與FRV小分子的共晶結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RV結(jié)合于FER激酶的ATP口袋（圖1），與Lys565、Tyr610、Tyr612、Met613、Asp679等關(guān)鍵殘基通過氫鍵和π-π堆積作用穩(wěn)定結(jié)合。FRV解離常數(shù)（0.4 μM）遠(yuǎn)低于對照ATP (18.37 μM），表明FRV是一種高效的ATP競爭性抑制劑。ADP-Glo激酶活性檢測實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)RV對FER的IC50值為70 nM，活性優(yōu)于之前發(fā)現(xiàn)的其他抑制劑。進(jìn)一步獲取了關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)的點(diǎn)突變體包括K565A、Y610A、Y612A、M613A和D679A的，驗(yàn)證了FRV和FER的分子結(jié)合機(jī)制。體外酶活實(shí)驗(yàn)表明K565A、Y610A和D679A突變顯著削弱FRV抑制效果（IC50> 100 μM），且Y612A和M613A突變也會(huì)降低激酶基礎(chǔ)活性。表面等離子共振實(shí)驗(yàn)顯示Y612A突變導(dǎo)致FRV結(jié)合親和力降低超1000倍，凸顯該殘基在抑制劑識(shí)別中的關(guān)鍵作用。以上結(jié)果共同證實(shí)FER的ATP結(jié)合口袋中五個(gè)關(guān)鍵殘基對FRV高效抑制FER激酶功能具有重要作用。

圖1. 共晶結(jié)構(gòu)揭示FRV占據(jù)FER激酶ATP結(jié)合口袋

通過激酶活性（圖2A）和表面等離子體實(shí)驗(yàn)（圖2B-F）評(píng)估FRV的選擇性，結(jié)果顯示其對FER激酶具有高度特異性，結(jié)合親和力顯著高于TMK4、BRI1等其它重要植物激酶，選擇性差異達(dá)數(shù)十倍。結(jié)構(gòu)分析與分子對接表明，F(xiàn)RV與FER結(jié)合口袋中關(guān)鍵殘基（K565、Y610等）形成的疏水作用及氫鍵網(wǎng)絡(luò)是其選擇性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，且結(jié)合構(gòu)象更為穩(wěn)定。此外，關(guān)鍵殘基在苔蘚和多種代表性被子植物中高度保守，揭示FRV具備廣譜抑制多物種中FER激酶的潛力。

圖2. 酶活與結(jié)合親和力分析揭示FRV對FER激酶的抑制機(jī)制

通過磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)RALF1小肽誘導(dǎo)了FER關(guān)鍵位點(diǎn)S695的磷酸化，而FRV處理抑制該位點(diǎn)的磷酸化（圖3A）。進(jìn)一步通過組間的差異比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RV通過阻斷FER–RALF1的磷酸化，干擾了其下游信號(hào)通路。RALF1/CK和RALF1/(FRV+RALF1)之間有345個(gè)共同上調(diào)和364個(gè)共同下調(diào)的磷酸化蛋白（圖3B）。對這些共同蛋白進(jìn)行GO分析，結(jié)果顯示主要富集于細(xì)胞生長、分裂、極性建成、細(xì)胞骨架組織等生物學(xué)過程（圖3C）。

圖3. 磷酸化組學(xué)發(fā)現(xiàn)FRV影響RALF1–FER信號(hào)通路

組學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)在RALF1–FER介導(dǎo)的磷酸化蛋白中，質(zhì)子泵AHA1/2的 S899位點(diǎn)磷酸化水平顯著上調(diào)（圖4B）。通過進(jìn)一步檢測主根表皮分生區(qū)細(xì)胞的伸長情況，發(fā)現(xiàn)FRV能夠抑制RALF1–FER調(diào)控的細(xì)胞伸長過程（圖4A）。通過檢測細(xì)胞長度和胞外pH水平，發(fā)現(xiàn)AHA2S899D轉(zhuǎn)基因株系對RALF1呈現(xiàn)不敏感，而FRV可有效抑制RALF1效果（圖4C, D）。通過構(gòu)建多種組合的單點(diǎn)突和多點(diǎn)突變體轉(zhuǎn)基因材料，發(fā)現(xiàn)FRV抑制FER的活性主要是通過影響其中兩個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)Y610和K565，而Y612、M613和D679的影響相對較小（圖4E）。

圖4. RALF1–FER通過AHA1/2S899介導(dǎo)的胞外堿化作用調(diào)控細(xì)胞伸長

磷酸化蛋白組學(xué)還揭示了FRV抑制RALF1誘導(dǎo)的FER S695位點(diǎn)的磷酸化，而利用廣譜磷酸化抗體檢測，結(jié)果顯示FRV處理有效抑制了RALF1誘導(dǎo)的FER磷酸化（圖5A）。同時(shí)，采用制備的FER S695/T696磷酸化特異性抗體進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)RALF1處理顯著促進(jìn)野生型中FER的磷酸化水平升高（圖5B）。通過檢測細(xì)胞長度和胞外pH水平，發(fā)現(xiàn)FERS695A突變體對RALF1處理不敏感（圖5C, D）。以上結(jié)果表明通過FRV的處理和分析，有效地找出了S695是FER感受RALF1小肽而激活的關(guān)鍵位點(diǎn)，其對于調(diào)控細(xì)胞伸長具有重要作用。

圖5. RALF1通過激活FER-S695A磷酸化調(diào)控細(xì)胞伸長

綜上所述，本研究篩選出高效選擇性的FER激酶小分子抑制劑FRV，通過共晶結(jié)構(gòu)解析等發(fā)現(xiàn)其特異性結(jié)合于FER激酶區(qū)的ATP口袋，從而抑制FER激酶活性。利用小分子工具FRV并結(jié)合磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)RALF1信號(hào)處理引起的關(guān)鍵磷酸化位點(diǎn)S695位點(diǎn)激活FER、引發(fā)下游AHA1/2質(zhì)子泵S899位點(diǎn)的磷酸化，從而調(diào)控主根表皮分生區(qū)細(xì)胞生長。本研究闡明了FRV小分子化合物是FER有效的激酶抑制劑，該抑制劑對于解析FER受體激酶參與的生物學(xué)過程的研究和信號(hào)機(jī)制的解析具有重要輔助作用，并有望成為農(nóng)作物遠(yuǎn)緣雜交育種和免疫調(diào)控的重要工具。

華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李超教授和北京大學(xué)雷曉光教授為共同通訊作者，北京大學(xué)博士后孫萌澤和華東師范大學(xué)博士后逯佰艷為共同第一作者，上海師范大學(xué)戴紹軍教授和任巍巍博士參與了該項(xiàng)研究。該工作得到了國家自然科學(xué)基金杰出青年基金和重點(diǎn)項(xiàng)目、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)項(xiàng)目、The National Science Foundation of the US、北京分子科學(xué)國家研究中心、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心和博士后面上項(xiàng)目等的支持。

論文鏈接：

https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2515322122